毛細管電泳分離蛋白質的研究進展概論

宮紅梅

【摘要】本文綜述了高效毛細管電泳的分離原理及模式，蛋白質的分離特性及抑制吸附的方法，電滲流的影響因素和控制方法。

【關鍵詞】高效毛細管電泳;蛋白質;電滲流

1.背景

毛細管電泳法由于其特有的快速，高效，簡單，成本低等特點也越來越多的應用于蛋白質的研究中，如多肽的分析，蛋白質的細微結構差異分析，以及鑒定蛋白質的純度，蛋白質反應動力學過程，測定蛋白質的分子量等[1]。

2.毛細管電泳在蛋白分離中的應用

2.1 高效毛細管電泳用于蛋白質分離的模式

（1）毛細管區帶電泳：HPCE中最簡單的、應用最廣泛的一種方式，毛細管內只充入緩沖溶液，分離過程中電滲流由毛細管內壁表面電荷所引起的管內液體的整體流動起著主導作用。一組化合物中，陽離子遷移最快，中性物質居中，而陰離子速度最慢。被分析物中各化合物帶電荷數差別越大，相對分子質量的差別越大，分離度越大，但所有的中性物質彼此不能分離。

（2）膠束電動毛細管色譜（MECC或MEKC）：結合了電泳技術與色譜技術，也是HPCE中應用最廣的方式之一。MECC是唯一的既能分離中性組分又能分離帶電組分的電泳技術。其原理是在緩沖溶液中加入表面活性劑，如果表面活性劑的濃度達到臨界濃度，則表面活性劑單體就結合在一起形成膠束。在緩沖液中添加的表面活性劑具有吸附、增溶、形成膠束等功能，因此增加了該模式分離化合物的范圍[2]。

（3）毛細管凝膠電泳（GCE）：毛細管內填充凝膠或其他篩分介質，荷質比相同但大小不同的分子，在電場力的推動下經凝膠聚合物構成的網狀介質中電泳受到的阻力不同達到分離。鑒于凝膠的一些缺點，最近有高分子聚合物代替凝膠，在毛細管中形成動態的網狀結構，溶質在網格中發生相對移動，從而依靠分子大小進行分離，即無膠篩分毛細管電泳（NGSCE）。

（4）毛細管等電聚焦（CIEF）：當兩性物質在毛細管中形成pH梯度時，不同等電點的物質在外電場作用下向等電點的pH值范圍遷移，當溶質遷移到等于其等電點范圍時，就不再移動，形成一個窄的溶質帶，使具有不同等電點的蛋白質可以分離。

2.2 蛋白質的化學性質及對分離的影響

蛋白質是由氨基酸通過酰胺鍵連接而成的高分子，氨基酸屬兩性分子，并有堿性、中性、酸性之分。對應的蛋白質也是兩性物質，亦有堿性、中性和酸性之分。蛋白質因其折迭方式、空間結構和修飾基因等的不同，還有親水或疏水之分。兩性物質所帶凈電荷為零時的pH值稱等電點pI。當所處環境大于等電點時，兩性物質帶負電荷;當所處環境小于等電點時，兩性物質帶正電荷。在CZE分離蛋白質混合物時，由于蛋白質所帶的電荷種類和密度不同達到分離[3]。但是，毛細管的表面硅羥基解離，帶負電荷，在分離的蛋白質的等電點大于電泳緩沖液的pH值時，會產生靜電吸附，除了硅醇負離子，融硅表面還會產生各種活性位點，如惰性硅氧橋和氫鍵位點，這些活性位點都會參與蛋白質的氫鍵和疏水區與管內壁的作用，因此很容易出現吸附問題，尤其是對堿性蛋白質。此外，由于毛細管內壁的不均一性，容易對蛋白質產生物理吸附，當分析物濃度在0.1-1.0mg/ml時，影響非常嚴重。不管是物理吸附還是化學吸附，都會導致峰拖尾，展寬，使分離效率下降，分離時間延長，重現性差，甚至電滲流消失，嚴重影響分離。因此，吸附問題是分離過程中要首要解決的[4]。

2.3 常用的解決吸附問題的方法

（1）采用極端pH值（pH8～11或pH<2）的緩沖溶液。Righetti等在pH值2.0-2.5時，為了克服高電導而不能加高電壓地缺點，提出了一種采用等電緩沖液的辦法，實現了僅一個中性氨基酸不同的兩條球蛋白鏈基線分離[5]。

（2）采用無機和有機添加劑的方法，緩沖液中含有高濃度的中性鹽，有機添加劑如二胺類、兩性電解質等都能競爭吸附位點，從而有效地抑制蛋白質的吸附。

（3）樣品處理：典型方法是用表面活性劑SDS，SDS結合變性的蛋白，消除了蛋白質本身的電荷量影響，使蛋白質依靠分子量大小得以分離。

（4）對毛細管內壁進行改性：主要是指采用物理涂敷或化學鍵合以及交聯等方法，在毛細管壁形成單分子層或交聯的涂層。通過涂層來阻止蛋白質與毛細管壁的相互作用，以達到減小蛋白質吸附的目的。由于涂層改變了毛細管壁的狀態，因而也會引起電滲流的變化。電中性的涂層會抑制電滲流，若是帶正電的高分子涂層則會使電滲流減小甚至反轉[6]。

（5）針對不同的被分析物，還有其他的抑制吸附的方法。任吉存，鄧延倬等在緩沖液中添加賴氨酸和精氨酸，它們在中性或微堿性的緩沖液里帶正電荷，能和帶負電的管壁靜電吸引結合，抑制了硅醇的解離，使相對遷移時間和相對峰高的重現性增強[7]。

毛細管電泳研究中，探索新的分離介質和新的分離模式可以提高分離效率和毛細管電泳的適用范圍[8，9]，這方面的研究工作一直在進展中。

3.結束語

毛細管電泳分離蛋白質具有其高效，快速，樣品量少，溶劑量少等特點，但對于實際蛋白質研究還存在一些問題，如吸附問題，分辨率問題，復雜組分的干擾等。各種新的分離模式和探索正在進行中。

參考文獻

[1]李林，吳家睿.蛋白質組學的產生及其重要意義[J].生命科學，1999，11（2）：49-50.

[2]孔毅，吳如金.高效毛細管電泳及其在蛋白質、多肽分析中的應用[J].藥學進展[J].2000，24（4）：204-208.

[3]屠紅旻，夏其昌.毛細管電泳及其在生命科學中的應用[J].生命的化學，1994，14（6）：36-39.

[4]李敏.高效毛細管電泳中的電滲流及控制[J].淮北煤師院學報，2000，21（2）：39-42.

[5]張蕊，郭寶林.高效毛細管電泳技術用于生物堿的分析[J].中草藥2005，36（2）：1889-1892.

[6]S.P.Radko.CapillaryElectrophoresis.Proteins.AcademicPress.2000：4009-4014.

[7]Righetti P G，Bossi A，Olivieri E，Gelfi C.J.Biochem.Biophys.Methods，1999.

[8]康經武，陸豪杰.毛細管電泳涂層柱技術的進展[J].色譜，1998，16（1）：26-29.

[9]劉玉，顧峻領.聚合物涂層毛細管柱分離蛋白質的研究[J].北京理工大學學報，1995，4（2）：155-163.