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枸杞花中總多酚含量的測定

2014-10-22 10:07:01程劉柯貝盞臨張欣
湖北農業科學 2014年17期

程劉柯+貝盞臨+張欣

摘要:以水和95%乙醇為提取劑,采用超聲提取法提取寧夏枸杞 (Lycium barbarum L.) 花中的多酚類化合物。結果表明,水提取物和95%乙醇提取物中多酚類化合物分別含有60.75 mg和13.55 mg,總量為74.30 mg,約占干枸杞花的1.49%。

關鍵詞:枸杞 (Lycium barbarum L.);沒食子酸;總多酚

中圖分類號:O657.32 文獻標識碼:A 文章編號:0439-8114(2014)17-4164-03

Determing the Total Polyphenol Content in Lycium barbarum Flowers

CHENG Liu-ke, BEI Zhan-lin, ZHANG Xin

(College of Biological Science and Engineering,Beifang University of Nationalities,Yinchuan 750021, China)

Abstract: Using H2O and 95% ethanol solution as extractant, polyphenol compounds were extracted from the dry flowers power of flowers of Lycium barbarum L. in Ningxia with ultrasonic-wave method. The results showed that 60.75 mg and 13.55 mg of polyphenol compounds were obtained from the extractive by H2O and 95% ethanol, solution respectively, accounting for 1.49% of dry flower.

Key words: Lycium barbarum L. flower; gallic acid; total polyphenol

枸杞(Lycium barbarum L.)全身是寶,《本草綱目》記載,“春采枸杞葉,名天精草;夏采花,名長生草;秋采子,名枸杞子;冬采根,名地骨皮”。枸杞花通常單生或二至數朵簇生于葉腋或短枝上紫色或淡紫色,花梗細,花期4~10月。對枸杞的藥用成分及藥用機理等相關研究已相當深入。

多酚是一大類廣泛存在于植物體內的次生代謝產物,其含量僅次于纖維素、半纖維素和木質素。狹義上認為植物多酚是單寧或鞣質;廣義上還包括小分子酚類化合物,如花青素、兒茶素、櫟精、沒食子酸等[1,2]。目前植物多酚在很多方面都有深入研究[3-5],例如,在農業生產(用于制螯合肥料),生態環境保護(用來降低廢水中重金屬毒害),食品工業(用作天然抗氧化劑),醫藥(具有抑菌、抗病毒、抗癌等作用)等方多面都有深入的研究,多酚類化合物具有很大的應用價值。對枸杞花方面,沈劍明等[6]研究了寧夏枸杞的花聯合現象,劉蘭英等[7]對枸杞花色素提取工藝進行了研究,貝盞臨等[8,9]研究了枸杞花的抗氧化活性、作用以及其總黃酮的含量,其他有關枸杞花有效成分方面的研究尚未見報道。本研究對枸杞花的總多酚含量進行了相關研究,旨在為今后探索枸杞花的活性功能因子,為枸杞花的食用和開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料 新鮮的枸杞花于2012年8月采自寧夏中寧縣康灘枸杞園,標本保存于北方民族大學生物科學系植物標本室。將新鮮枸杞花(寧杞1號)放置于陰涼處陰干,然后用粉碎機進行粉碎,粉碎后的粉末放入干凈的密封塑料袋中保藏備用。

1.1.2 藥品 沒食子酸、Folin-Ciocalteu(1 mol/L)、碳酸鈉、無水乙醇(99.5%),以上試劑均為分析純,均購自北京化學試劑公司。

1.1.3 試驗器材 FW100型高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)、FA2104B型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)、KQ-500B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)、減壓蒸餾裝置、ALPHA型冷凍干燥機(德國Marin Christ 公司)、4K15型離心機(Sigma公司)、UV765型紫外-可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的制備

1)水提取物的制備。稱取粉碎后的枸杞花5.0 g,置于250 mL錐形瓶,加入去離子水100 mL,用超聲儀(40 kHz,50 ℃)超聲提取50 min,得到的提取液經真空抽濾,得到澄清的提取液。殘渣用去離子水洗滌,并在相同的條件下提取2~3次,收集提取液,合并,減壓蒸餾得到濃縮液。

2)乙醇提取物的制備:向去離子水提取后的枸杞花殘渣中加入60%的乙醇溶液,提取方法及步驟與去離子水提取方法相同。然后,再依次用85%和95%的乙醇對經60%乙醇提取后的殘渣再次進行提取。合并以上60%、85%和95%乙醇提取液,對所得提取液進行減壓蒸餾,得到乙醇提取液。將以上所得的乙醇提取液在-70 ℃下冷凍過夜。最后,用真空干燥機進行真空干燥,真空干燥時間為27 h,干燥結束后收集粉末狀物質。向粉末狀物體中加入95%乙醇溶液,得到可溶于95%乙醇溶液與不溶于95%乙醇溶液的沉淀。經10 000 r/min離心15 min后,得到上清液,上清液即為溶于95%乙醇溶液,記錄最終體積,標記為樣品95%乙醇提取物,4 ℃下保藏備用。離心得到的沉淀加入適量的去離子水,大部分溶于去離子水,再經10 000 r/min離心15 min,得到溶于去離子水的上清液,此上清液與去離子水提取物溶液合并到一起,并記錄最終的總體積,標記為樣品水提取物,在4 ℃下保藏備用。endprint

1.2.2多酚類化合物的測定 多酚類化合物的測定方法參照[10-12],略有改動。

1)最大吸收波長的確定:精確稱取干燥至恒重的沒食子酸5.0 mg,置于100 mL棕色容量瓶中,用去離子水溶解,定容至刻度,搖勻,即得到0.05 mg/mL沒食子酸標準溶液。精確吸取0.05 mg/mL沒食子酸標準溶液2 mL,加入Folin-Ciocalteu試劑1 mL和7.5%碳酸鈉溶液8 mL;充分混勻后,在50 ℃水浴下保持10 min;迅速冷卻。同時,以未加入沒食子酸的溶液作為空白溶液,于紫外-可見分光光度計在400~900 nm下進行掃描。檢測最大吸收峰,最大吸收峰為753 nm。

2)多酚類化合物標準曲線的繪制:精確吸取沒食子酸標準溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL,于已標記好0、1、2、3、4、5、6、7號的25 mL棕色容量瓶中;再依次加入Folin-Ciocalteu試劑1 mL和7.5%碳酸鈉溶液8 mL;最后用去離子水定容到25 mL;充分混勻,在50 ℃水浴下保持10 min;迅速冷卻。以0號作對照,于753 nm處測定不同濃度的沒食子酸對應的吸光值。其中,0-7號標準樣最終得到的濃度為0.000、0.001、0.002、0.003、0.005、0.006、0.007 mg/mL。做3組重復,取平均值,繪制標準曲線,并得出回歸方程。

3)樣品水提取物中多酚類化合物的測定:將樣品水提取物稀釋10倍;精確吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL液體于已標記好0、1、2、3、4、5、6號的25 mL棕色容量瓶中。其余步驟同上。做3組重復,以0號作對照,于753 nm處測定吸光度。取平均值,記錄各組數據,繪制出吸光度隨樣品水提取物體積變化的曲線。在曲線上找到樣品水提取物稀釋10倍,取1 mL樣品所得到的吸光度值,根據標準曲線得到相對應的沒食子酸的濃度,進而得出樣品水提取物的多酚類化合物的含量。

4)樣品95%乙醇提取物中多酚類化合物的測定:精確吸取樣品95%乙醇提取物溶液0.0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mL于已標記0、1、2、3、4、5、6號的25 mL棕色容量瓶中,其他步驟同樣品水提取物的測定步驟。記錄各組數據,繪制出吸光度隨樣品95%乙醇提取物體積的變化曲線。在曲線上找到1 mL 95%乙醇提取物溶液所對應的吸光度值,根據標準曲線得到相對應的沒食子酸的濃度,進而得到95%乙醇提取物的多酚類化合物的含量。

由水提取物與95%乙醇提取物分別測定的多酚類化合物的含量可得出5 g枸杞干花粉末中含有的多酚類化合物的含量。

2 結果與分析

2.1 不同溶劑提取所得體積

樣品水提取物的總體積為81 mL,樣品95%乙醇提取物的總體積為126 mL。根據樣品的總體積計算多酚類化合物和黃酮類化合物的總量。

2.2 多酚類化合物結果分析

在400~900 nm范圍內進行掃描,檢測出最大吸收峰波長為753 nm。由以上數據及曲線(表1-表3;圖1-圖3)表明,多酚類化合物標準曲線的線性回歸方程為:y= 100.500 0x+0.013 5(R2=0.999 3)。以沒食子酸為標準品測定的多酚類化合物標準曲線呈現較好的線性關系。

樣品水提取物稀釋10倍后,測定多酚類化合物得到的線性回歸方程為:y=0.325 2x-0.006 0 (R2=0.998 3)。則樣品水提取物稀釋10倍后,取1 mL測定的吸光度為0.319 2,由標準曲線得到的沒食子酸濃度為0.003 0 mg/L,則樣品水提取物的多酚類化合物總量為60.75 mg。樣品95%乙醇提取物中多酚類化合物測定得到的線性回歸方程為:y= 0.399 3x+0.045 5 (R2=0.993 4)。同樣的可以計算出樣品95%乙醇提取物中多酚類化合物總量為13.55 mg??芍喾宇惢衔锎蠖嗫扇苡谒苄缘亩喾宇惢衔餅榇既苄缘?.48倍。5 g枸杞干花中含有的多酚類化合物為74.30 mg,即枸杞花中多酚類化合物含量約占1.49%。

3 小結與討論

采摘的寧夏本地的枸杞花陰干后,對干枸杞花依次采用水、60%、85%、95%乙醇反復提取,并借用超聲波(40 kHz)在50 ℃下提取50 min。得到的提取物經減壓濃縮,真空抽濾等步驟,最終得到水相(樣品水提取物為81 mL)和醇相(樣品95%乙醇提取物為126 mL)兩種提取物。采用Folin-Ciocalteu法,以沒食子酸為參照品,在753 nm處測定樣品水提取物、95%乙醇提取物中多酚類化合物,得到兩者含量分別為60.75 mg和13.55 mg,很顯然水相中的多酚類化合物比醇相中的多,是其4.48倍,其中總多酚類化合物含量為74.30 mg,約占干枸杞花的1.49%。

參考文獻:

[1] 尹志娜.植物多酚分離提取方法和生物功能研究進展[J].生命科學儀器,2010,8(6):43-49.

[2] 李群梅,楊昌鵬,等.植物多酚提取與分離方法的研究進展[J].保鮮與加工, 2010,10(1):16-19.

[3] 李 健,楊昌鵬.植物多酚的應用研究進展[J].廣西輕工業, 2008(12):1-3.

[4] 陳 曌,曾健青,左雄軍,等.迷迭香脂溶性抗氧化劑總酚測定及其穩定性研究[J].中國食品添加劑,2011(2):83-86.

[5] 陳 晨,文懷秀,羅智敏,等.白刺色素和黑果枸杞色素中花色苷與總多酚的測定[J].光譜實驗室.2010,27(5):1796-1798.

[6] 沈劍明,劉曉峰.寧夏枸杞的花聯合現象[J].西北植物學報, 1990,10(3):221-224.

[7] 劉蘭英,曹有龍.枸杞花花色素提取工藝研究[J].安徽農業科學, 2010,38(32):18140-18141.

[8] 貝盞臨,張 欣,曹君邁,等.枸杞花總黃酮的測定[J].湖北農業科學,2012,51(6):1240-1241.

[9] 張 欣,曹君邁,貝盞臨,等.枸杞花抗氧化作用的研究[J].江蘇農業科學,2012,40(3):301-303.

[10] 韓 菊,魏福祥.Folin-Ciocalteu比色法測定蘋果渣中的多酚[J]. 食品科學,2010,31(4):179-182.

[11] 李巨秀,王柏玉.福林-酚比色法測定桑葚中的總多酚[J].食品科學,2009,30(18):292-295.

[12] 丁 明,鐘冬蓮.茶油中總酚的測定方法[J].浙江農業科學, 2010,30(6):1369-1371.endprint

1.2.2多酚類化合物的測定 多酚類化合物的測定方法參照[10-12],略有改動。

1)最大吸收波長的確定:精確稱取干燥至恒重的沒食子酸5.0 mg,置于100 mL棕色容量瓶中,用去離子水溶解,定容至刻度,搖勻,即得到0.05 mg/mL沒食子酸標準溶液。精確吸取0.05 mg/mL沒食子酸標準溶液2 mL,加入Folin-Ciocalteu試劑1 mL和7.5%碳酸鈉溶液8 mL;充分混勻后,在50 ℃水浴下保持10 min;迅速冷卻。同時,以未加入沒食子酸的溶液作為空白溶液,于紫外-可見分光光度計在400~900 nm下進行掃描。檢測最大吸收峰,最大吸收峰為753 nm。

2)多酚類化合物標準曲線的繪制:精確吸取沒食子酸標準溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL,于已標記好0、1、2、3、4、5、6、7號的25 mL棕色容量瓶中;再依次加入Folin-Ciocalteu試劑1 mL和7.5%碳酸鈉溶液8 mL;最后用去離子水定容到25 mL;充分混勻,在50 ℃水浴下保持10 min;迅速冷卻。以0號作對照,于753 nm處測定不同濃度的沒食子酸對應的吸光值。其中,0-7號標準樣最終得到的濃度為0.000、0.001、0.002、0.003、0.005、0.006、0.007 mg/mL。做3組重復,取平均值,繪制標準曲線,并得出回歸方程。

3)樣品水提取物中多酚類化合物的測定:將樣品水提取物稀釋10倍;精確吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL液體于已標記好0、1、2、3、4、5、6號的25 mL棕色容量瓶中。其余步驟同上。做3組重復,以0號作對照,于753 nm處測定吸光度。取平均值,記錄各組數據,繪制出吸光度隨樣品水提取物體積變化的曲線。在曲線上找到樣品水提取物稀釋10倍,取1 mL樣品所得到的吸光度值,根據標準曲線得到相對應的沒食子酸的濃度,進而得出樣品水提取物的多酚類化合物的含量。

4)樣品95%乙醇提取物中多酚類化合物的測定:精確吸取樣品95%乙醇提取物溶液0.0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mL于已標記0、1、2、3、4、5、6號的25 mL棕色容量瓶中,其他步驟同樣品水提取物的測定步驟。記錄各組數據,繪制出吸光度隨樣品95%乙醇提取物體積的變化曲線。在曲線上找到1 mL 95%乙醇提取物溶液所對應的吸光度值,根據標準曲線得到相對應的沒食子酸的濃度,進而得到95%乙醇提取物的多酚類化合物的含量。

由水提取物與95%乙醇提取物分別測定的多酚類化合物的含量可得出5 g枸杞干花粉末中含有的多酚類化合物的含量。

2 結果與分析

2.1 不同溶劑提取所得體積

樣品水提取物的總體積為81 mL,樣品95%乙醇提取物的總體積為126 mL。根據樣品的總體積計算多酚類化合物和黃酮類化合物的總量。

2.2 多酚類化合物結果分析

在400~900 nm范圍內進行掃描,檢測出最大吸收峰波長為753 nm。由以上數據及曲線(表1-表3;圖1-圖3)表明,多酚類化合物標準曲線的線性回歸方程為:y= 100.500 0x+0.013 5(R2=0.999 3)。以沒食子酸為標準品測定的多酚類化合物標準曲線呈現較好的線性關系。

樣品水提取物稀釋10倍后,測定多酚類化合物得到的線性回歸方程為:y=0.325 2x-0.006 0 (R2=0.998 3)。則樣品水提取物稀釋10倍后,取1 mL測定的吸光度為0.319 2,由標準曲線得到的沒食子酸濃度為0.003 0 mg/L,則樣品水提取物的多酚類化合物總量為60.75 mg。樣品95%乙醇提取物中多酚類化合物測定得到的線性回歸方程為:y= 0.399 3x+0.045 5 (R2=0.993 4)。同樣的可以計算出樣品95%乙醇提取物中多酚類化合物總量為13.55 mg。可知多酚類化合物大多可溶于水,水溶性的多酚類化合物為醇溶性的4.48倍。5 g枸杞干花中含有的多酚類化合物為74.30 mg,即枸杞花中多酚類化合物含量約占1.49%。

3 小結與討論

采摘的寧夏本地的枸杞花陰干后,對干枸杞花依次采用水、60%、85%、95%乙醇反復提取,并借用超聲波(40 kHz)在50 ℃下提取50 min。得到的提取物經減壓濃縮,真空抽濾等步驟,最終得到水相(樣品水提取物為81 mL)和醇相(樣品95%乙醇提取物為126 mL)兩種提取物。采用Folin-Ciocalteu法,以沒食子酸為參照品,在753 nm處測定樣品水提取物、95%乙醇提取物中多酚類化合物,得到兩者含量分別為60.75 mg和13.55 mg,很顯然水相中的多酚類化合物比醇相中的多,是其4.48倍,其中總多酚類化合物含量為74.30 mg,約占干枸杞花的1.49%。

參考文獻:

[1] 尹志娜.植物多酚分離提取方法和生物功能研究進展[J].生命科學儀器,2010,8(6):43-49.

[2] 李群梅,楊昌鵬,等.植物多酚提取與分離方法的研究進展[J].保鮮與加工, 2010,10(1):16-19.

[3] 李 健,楊昌鵬.植物多酚的應用研究進展[J].廣西輕工業, 2008(12):1-3.

[4] 陳 曌,曾健青,左雄軍,等.迷迭香脂溶性抗氧化劑總酚測定及其穩定性研究[J].中國食品添加劑,2011(2):83-86.

[5] 陳 晨,文懷秀,羅智敏,等.白刺色素和黑果枸杞色素中花色苷與總多酚的測定[J].光譜實驗室.2010,27(5):1796-1798.

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[7] 劉蘭英,曹有龍.枸杞花花色素提取工藝研究[J].安徽農業科學, 2010,38(32):18140-18141.

[8] 貝盞臨,張 欣,曹君邁,等.枸杞花總黃酮的測定[J].湖北農業科學,2012,51(6):1240-1241.

[9] 張 欣,曹君邁,貝盞臨,等.枸杞花抗氧化作用的研究[J].江蘇農業科學,2012,40(3):301-303.

[10] 韓 菊,魏福祥.Folin-Ciocalteu比色法測定蘋果渣中的多酚[J]. 食品科學,2010,31(4):179-182.

[11] 李巨秀,王柏玉.福林-酚比色法測定桑葚中的總多酚[J].食品科學,2009,30(18):292-295.

[12] 丁 明,鐘冬蓮.茶油中總酚的測定方法[J].浙江農業科學, 2010,30(6):1369-1371.endprint

1.2.2多酚類化合物的測定 多酚類化合物的測定方法參照[10-12],略有改動。

1)最大吸收波長的確定:精確稱取干燥至恒重的沒食子酸5.0 mg,置于100 mL棕色容量瓶中,用去離子水溶解,定容至刻度,搖勻,即得到0.05 mg/mL沒食子酸標準溶液。精確吸取0.05 mg/mL沒食子酸標準溶液2 mL,加入Folin-Ciocalteu試劑1 mL和7.5%碳酸鈉溶液8 mL;充分混勻后,在50 ℃水浴下保持10 min;迅速冷卻。同時,以未加入沒食子酸的溶液作為空白溶液,于紫外-可見分光光度計在400~900 nm下進行掃描。檢測最大吸收峰,最大吸收峰為753 nm。

2)多酚類化合物標準曲線的繪制:精確吸取沒食子酸標準溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL,于已標記好0、1、2、3、4、5、6、7號的25 mL棕色容量瓶中;再依次加入Folin-Ciocalteu試劑1 mL和7.5%碳酸鈉溶液8 mL;最后用去離子水定容到25 mL;充分混勻,在50 ℃水浴下保持10 min;迅速冷卻。以0號作對照,于753 nm處測定不同濃度的沒食子酸對應的吸光值。其中,0-7號標準樣最終得到的濃度為0.000、0.001、0.002、0.003、0.005、0.006、0.007 mg/mL。做3組重復,取平均值,繪制標準曲線,并得出回歸方程。

3)樣品水提取物中多酚類化合物的測定:將樣品水提取物稀釋10倍;精確吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL液體于已標記好0、1、2、3、4、5、6號的25 mL棕色容量瓶中。其余步驟同上。做3組重復,以0號作對照,于753 nm處測定吸光度。取平均值,記錄各組數據,繪制出吸光度隨樣品水提取物體積變化的曲線。在曲線上找到樣品水提取物稀釋10倍,取1 mL樣品所得到的吸光度值,根據標準曲線得到相對應的沒食子酸的濃度,進而得出樣品水提取物的多酚類化合物的含量。

4)樣品95%乙醇提取物中多酚類化合物的測定:精確吸取樣品95%乙醇提取物溶液0.0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mL于已標記0、1、2、3、4、5、6號的25 mL棕色容量瓶中,其他步驟同樣品水提取物的測定步驟。記錄各組數據,繪制出吸光度隨樣品95%乙醇提取物體積的變化曲線。在曲線上找到1 mL 95%乙醇提取物溶液所對應的吸光度值,根據標準曲線得到相對應的沒食子酸的濃度,進而得到95%乙醇提取物的多酚類化合物的含量。

由水提取物與95%乙醇提取物分別測定的多酚類化合物的含量可得出5 g枸杞干花粉末中含有的多酚類化合物的含量。

2 結果與分析

2.1 不同溶劑提取所得體積

樣品水提取物的總體積為81 mL,樣品95%乙醇提取物的總體積為126 mL。根據樣品的總體積計算多酚類化合物和黃酮類化合物的總量。

2.2 多酚類化合物結果分析

在400~900 nm范圍內進行掃描,檢測出最大吸收峰波長為753 nm。由以上數據及曲線(表1-表3;圖1-圖3)表明,多酚類化合物標準曲線的線性回歸方程為:y= 100.500 0x+0.013 5(R2=0.999 3)。以沒食子酸為標準品測定的多酚類化合物標準曲線呈現較好的線性關系。

樣品水提取物稀釋10倍后,測定多酚類化合物得到的線性回歸方程為:y=0.325 2x-0.006 0 (R2=0.998 3)。則樣品水提取物稀釋10倍后,取1 mL測定的吸光度為0.319 2,由標準曲線得到的沒食子酸濃度為0.003 0 mg/L,則樣品水提取物的多酚類化合物總量為60.75 mg。樣品95%乙醇提取物中多酚類化合物測定得到的線性回歸方程為:y= 0.399 3x+0.045 5 (R2=0.993 4)。同樣的可以計算出樣品95%乙醇提取物中多酚類化合物總量為13.55 mg??芍喾宇惢衔锎蠖嗫扇苡谒苄缘亩喾宇惢衔餅榇既苄缘?.48倍。5 g枸杞干花中含有的多酚類化合物為74.30 mg,即枸杞花中多酚類化合物含量約占1.49%。

3 小結與討論

采摘的寧夏本地的枸杞花陰干后,對干枸杞花依次采用水、60%、85%、95%乙醇反復提取,并借用超聲波(40 kHz)在50 ℃下提取50 min。得到的提取物經減壓濃縮,真空抽濾等步驟,最終得到水相(樣品水提取物為81 mL)和醇相(樣品95%乙醇提取物為126 mL)兩種提取物。采用Folin-Ciocalteu法,以沒食子酸為參照品,在753 nm處測定樣品水提取物、95%乙醇提取物中多酚類化合物,得到兩者含量分別為60.75 mg和13.55 mg,很顯然水相中的多酚類化合物比醇相中的多,是其4.48倍,其中總多酚類化合物含量為74.30 mg,約占干枸杞花的1.49%。

參考文獻:

[1] 尹志娜.植物多酚分離提取方法和生物功能研究進展[J].生命科學儀器,2010,8(6):43-49.

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