外植體預培養時間對番茄外源基因轉化的影響

李猷+尹蕾+唐凱悅+律鳳霞

摘要：以番茄葉片為外植體，含有煙草花葉病毒外殼蛋白（TMV-rep）基因的工程農桿菌LBA4404為外源基因轉化的雙元載體，通過農桿菌葉盤法將外源基因轉入番茄，轉化前將番茄葉片進行不同時間預培養，研究外植體預培養時間對外源基因轉化率的影響。結果表明，最適宜的預培養時間為32～48 h，番茄外植體轉化率均達到70%以上。

關鍵詞：番茄；煙草花葉病毒；預培養時間；轉化率

中圖分類號：S641.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）17-4208-03

Effects of Pre-culture Time of Explants on the Exogenous Gene

Transformation in Tomato

LI You，YIN Lei，TANG Kai-yue，L？譈 Feng-xia

（Department of Biology， Mudanjiang Normal College， Mudanjiang 157011， Heilongjiang， China）

Abstract： The leaves of tomato were used as explants and the Agrobacterium （LBA4404） was used as binary vector containing tobacco mosaic virus replicase gene（TMV-rep）， the pre-culture time before transformation was optimized. The results showed that the pre-culture time had significant effects on transgenic rate. The optimal pre-culture time was 32～48 hours，with transformation rate of more than 70%.

Key words：tomato；tobacco mosaic virus；pre-culture time； transgenic rate

番茄是世界上最主要的蔬菜作物之一，營養豐富，味道鮮美。隨著番茄種植區域和面積的不斷擴大，病蟲害成為影響番茄產量和品質的重要因素，造成的損失可達50%～100%[1]。病毒病是番茄的主要病害之一，每年造成番茄不同程度減產。危害番茄的病毒主要有煙草花葉病毒（TMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、黃瓜卷葉病毒（TYL2CV）、苜蓿花葉病毒（AIMV）和番茄斑萎病毒（TSWV）等[2]。可以通過常規雜交或回交等手段，獲得綜合性狀表現優良且抗病的番茄品種，但常規育種手段在提高番茄抗病性方面進展速度有限，而以病毒來源的基因介導抗性所取得的成就較大。目前，番茄抗病毒病基因工程培育出了能穩定遺傳的抗病毒植株，除外殼蛋白基因外，在番茄上主要采用衛星RNA基因、反義RNA基因等方法獲得抗病毒番茄。通過RNA干擾技術獲得的抗病毒轉基因植物符合人們對生物安全性的高要求，但這種技術在番茄上的應用不多[3-5]。尤其是RNA干擾外源基因載體對番茄轉化時，轉化率成為限制轉化成功的主要因素之一[3-5]。本試驗以含有煙草花葉病毒外殼蛋白（TMV-rep）基因的工程農桿菌介導，將外源基因向番茄中轉化，以番茄葉片為外植體，通過不同時間的外植體預培養后再進行常規基因轉化，篩選外源基因轉化體系的最佳外植體預培養時間[6-11]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

番茄種子：購于牡丹江市種子商店。

基因雙元載體工程菌：含煙草花葉病毒外殼蛋白（TMV-rep）基因的農桿菌LBA4404，黑龍江省煙草科學研究所中心實驗室提供。誘導愈傷組織及芽分化的培養基為MS培養基（其中添加0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA）。

1.2 藥劑和儀器

藥劑：奈乙酸（NAA）、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、卡那霉素（Kan）、羧芐青霉素（cb）、瓊脂粉、0.1%升汞、無水乙醇等，均為分析純。

儀器：日立Z-3000型紫外分光光度儀；美國BECKMAN高速冷凍離心機；水浴鍋；天平；電泳儀；培養箱等。

1.3 試驗方法

1.3.1 無菌材料的準備 取番茄種子2 g，放入無菌三角瓶中，先用75%乙醇進行表面消毒，再用消毒水（5%的漂白粉配制）的過濾液浸泡30 min。用無菌水沖洗9～10次，將沖洗干凈的種子放在無菌紙上，將水分吸干，小心放置在1/2MS培養基上，28 ℃培養室光照培養。7～10 d后番茄種子發芽， 長出小葉芽，將葉芽剪出傷口，平鋪在MS（含有0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA）培養基中，培養室內光照培養7～8 d。愈傷組織長出后，10～15 d轉入誘導生根培養基中，20 d左右可分化出番茄植株，25 d后從培養皿中取出，放在三角瓶中培養待用。

1.3.2 無菌番茄葉片預培養及侵染 將培養好的無菌番茄幼苗按葉盤法進行基因轉化前預培養，即將無菌番茄苗葉片剪成四周有傷口的葉盤，正面朝上擺在有MS固體培養基的培養皿上，按試驗設計的不同預培養時間（0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56 h）放入26 ℃培養室內光照預培養。

工程菌侵染預培養番茄具體過程：

1）取低溫保存含TMV-rep基因的農桿菌LBA4404，在YEB固體培養基[含50 mg/L Kan和50 mg/L利褔平（Rif）]低于28 ℃培養2 d。挑取單菌落接種于20 mL YEB液體培養基（含50 mg/L Kan和50 mg/L Rif）中，28 ℃震蕩（150 r/min）培養2～3 d。endprint

2）菌液生長到OD600 nm為0.3～0.7時，取25～30 mL倒入無菌離心管中，于4 ℃下5 000 r/min離心5 min，去掉上清液，用MS液體培養基將附在離心管壁上的菌液懸浮下來，倒入三角瓶中，27 ℃ 220 r/min搖床內繼續培養。

3）將搖床中的菌液取出，倒入事先放有不同預培養時間番茄葉片的無菌培養皿中，輕微搖勻，浸泡5～8 min。倒出菌液，將葉片夾出在吸水紙（無菌紙）上吸干表面的水分，放在MS液體培養基（含0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA）浸濕的無菌紙上，正面向上，再用無菌紙表面覆蓋一層，用MS液體共培養基封口，放入22 ℃培養箱暗培養。

4）培養3 d后，將材料分別轉至1號篩選培養基（MS固體培養基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +50 mg/L Kan+500 mg/L cb），傷口與培養基充分接觸，27 ℃下光照培養。

5）培養10～15 d統計分化芽數，30 d左右轉至2號篩選培養基（MS固體培養基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +100 mg/L Kan+250 mg/L cb）繼續觀察葉芽的變化，記錄葉芽黃化情況，根據黃化結果計算不同預培養時間番茄外植體的轉化率。

轉化率=未黃化的葉芽數/葉芽總數×100%

2 結果與分析

2.1 番茄愈傷組織培養

含煙草花葉病毒外殼蛋白（TMV-rep）基因的農桿工程菌LBA4404在構建過程中，添加了抗卡那霉素基因，轉化的番茄細胞會表現出對培養基中卡那霉素的抗性，故篩選培養基以卡那霉素濃度為選擇壓力。

從圖1可以看出，侵染后經暗培養的番茄葉片轉入1號篩選培養基后，葉片明顯膨大，葉邊緣傷口處形成大量愈傷組織。1號篩選培養基中羧芐青霉素的濃度較高為500 mg/L，以抑菌為主；而卡那霉素的濃度只有50 mg/L，以篩選轉化細胞為輔。所以葉緣傷口處愈傷組織包含轉化細胞和非轉化細胞，且數量較多。

由圖2可知，番茄愈傷組織轉入2號篩選培養基后，葉緣的愈傷組織出現小部分黃化，因為2號篩選培養基在1號培養基抑菌效果的基礎上降低了羧芐青霉素的濃度，為250 mg/L。減輕羧芐青霉素對愈傷組織生長的抑制作用；卡那霉素的濃度增加到100 mg/L，增加了對非轉化細胞的篩選壓力。少量非轉化細胞在較高的卡那霉素濃度下生長受到抑制，表現為細胞葉綠素減少，葉片愈傷細胞黃化，達到了篩選目的。

由圖3可知，2號培養基篩選后的轉化細胞不受卡那霉素濃度增加的影響，經過一段時間的培養出現生長正常的綠色分化芽，同時還有少量已經分化的芽在后期表現出黃化現象，是非轉化細胞分化后受培養基中高濃度卡那霉素的持續抑制產生的結果。可根據分化芽的黃化數量計算轉化率。

2.2 不同預培養時間對番茄外植體轉化率的影響

從表1可以看出，預培養8 h的番茄外植體轉化率與對照相比有所增加，但增加幅度不大。預培養32～48 h番茄外植體轉化率與對照相比明顯增加，其轉化率均大于70%，差異均達極顯著水平；當預培養時間超過48 h后，轉化率大幅度下降，預培養時間達到56 h時轉化率為0，說明此時番茄葉芽傷口可能已經愈合，這時菌液浸泡葉芽，工程菌細胞質粒中的T-DNA已不能向番茄細胞中轉移。

3 小結

本試驗結果表明，農桿菌介導的外源基因轉化過程中，不經預培養的番茄外植體經葉盤法轉化，轉化率相對較高，達到41.67%。在不同預培養時間內，最適宜的預培養時間為32～48 h，番茄外植體轉化率大幅度提高。番茄外植體經32～48 h的預培養后再進行常規的轉基因操作，此時工程菌細胞對葉芽邊緣的細胞傷口多數形成初愈傷，細胞完整吸附效果好，能明顯提高T-DNA區攜帶的外源目的基因向植物基因組轉化的成功率。

參考文獻：

[1] 沈福弟，沈進高，孫 軍，等.番茄主要病蟲害防治技術[J].上海蔬菜，2009（5）：72-73.

[2] 李 慧.加工番茄主要病蟲害的發生與防治對策[J].農村科技， 2008（4）：41.

[3] 周靜亞，徐忠傳，張保龍，等.AP70抗病基因轉化番茄的研究[J]. 安徽農業科學，2008，36（13）：5323-5324.

[4] 王全華，王秀峰.番茄抗病基因工程育種研究進展[J].山東農業大學學報（自然科學版），2003，34（4）： 600-604.

[5] 趙 爽，雷建軍，陳國菊，等.番茄抗病毒基因工程研究進展[J]. 生命科學研究，2007，41（11）：83-86.

[6] 律鳳霞，潘永明，郭兆奎.外源RNA干涉基因在煙草中的轉化及表達[J].西北植物學報，2009，29（10）：1962-1966.

[7] 律鳳霞，郭兆奎，顏培強，等.TMV復制酶基因靶向的RNA干涉載體構建[J].植物研究，2008，28（3）：310-314.

[8] 潘永明.根癌農桿菌介導外源基因轉化番茄體系優化[J].北方園藝，2010（18）：142-144.

[9] WANG Y H， MOSEBACH C M， KIBBEY A S， et al. Generation of Arabidopsis mutants by heterologous expression of a full-Length cDNA library from tomato[J].Plant Mol Biol Rep，2009，27（4）： 454-461.

[10] EOM H， LEE C G， JIN E. Gene expression profile analysis in astaxanthin-induced Haematococcus pluvialis using a cDNA microarray[J].Planta，2006，223（6）：1231-1242.

[11] LI W Z， CHINNAPPA C C. Isolation and characterization of PHYC gene from Stellaria longipes： Differential expression regulated by different red/far-red light ratios and photoperiods[J].Planta，2004，220（2）： 318-330.endprint

2）菌液生長到OD600 nm為0.3～0.7時，取25～30 mL倒入無菌離心管中，于4 ℃下5 000 r/min離心5 min，去掉上清液，用MS液體培養基將附在離心管壁上的菌液懸浮下來，倒入三角瓶中，27 ℃ 220 r/min搖床內繼續培養。

3）將搖床中的菌液取出，倒入事先放有不同預培養時間番茄葉片的無菌培養皿中，輕微搖勻，浸泡5～8 min。倒出菌液，將葉片夾出在吸水紙（無菌紙）上吸干表面的水分，放在MS液體培養基（含0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA）浸濕的無菌紙上，正面向上，再用無菌紙表面覆蓋一層，用MS液體共培養基封口，放入22 ℃培養箱暗培養。

4）培養3 d后，將材料分別轉至1號篩選培養基（MS固體培養基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +50 mg/L Kan+500 mg/L cb），傷口與培養基充分接觸，27 ℃下光照培養。

5）培養10～15 d統計分化芽數，30 d左右轉至2號篩選培養基（MS固體培養基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +100 mg/L Kan+250 mg/L cb）繼續觀察葉芽的變化，記錄葉芽黃化情況，根據黃化結果計算不同預培養時間番茄外植體的轉化率。

轉化率=未黃化的葉芽數/葉芽總數×100%

2 結果與分析

2.1 番茄愈傷組織培養

含煙草花葉病毒外殼蛋白（TMV-rep）基因的農桿工程菌LBA4404在構建過程中，添加了抗卡那霉素基因，轉化的番茄細胞會表現出對培養基中卡那霉素的抗性，故篩選培養基以卡那霉素濃度為選擇壓力。

從圖1可以看出，侵染后經暗培養的番茄葉片轉入1號篩選培養基后，葉片明顯膨大，葉邊緣傷口處形成大量愈傷組織。1號篩選培養基中羧芐青霉素的濃度較高為500 mg/L，以抑菌為主；而卡那霉素的濃度只有50 mg/L，以篩選轉化細胞為輔。所以葉緣傷口處愈傷組織包含轉化細胞和非轉化細胞，且數量較多。

由圖2可知，番茄愈傷組織轉入2號篩選培養基后，葉緣的愈傷組織出現小部分黃化，因為2號篩選培養基在1號培養基抑菌效果的基礎上降低了羧芐青霉素的濃度，為250 mg/L。減輕羧芐青霉素對愈傷組織生長的抑制作用；卡那霉素的濃度增加到100 mg/L，增加了對非轉化細胞的篩選壓力。少量非轉化細胞在較高的卡那霉素濃度下生長受到抑制，表現為細胞葉綠素減少，葉片愈傷細胞黃化，達到了篩選目的。

由圖3可知，2號培養基篩選后的轉化細胞不受卡那霉素濃度增加的影響，經過一段時間的培養出現生長正常的綠色分化芽，同時還有少量已經分化的芽在后期表現出黃化現象，是非轉化細胞分化后受培養基中高濃度卡那霉素的持續抑制產生的結果。可根據分化芽的黃化數量計算轉化率。

2.2 不同預培養時間對番茄外植體轉化率的影響

從表1可以看出，預培養8 h的番茄外植體轉化率與對照相比有所增加，但增加幅度不大。預培養32～48 h番茄外植體轉化率與對照相比明顯增加，其轉化率均大于70%，差異均達極顯著水平；當預培養時間超過48 h后，轉化率大幅度下降，預培養時間達到56 h時轉化率為0，說明此時番茄葉芽傷口可能已經愈合，這時菌液浸泡葉芽，工程菌細胞質粒中的T-DNA已不能向番茄細胞中轉移。

3 小結

本試驗結果表明，農桿菌介導的外源基因轉化過程中，不經預培養的番茄外植體經葉盤法轉化，轉化率相對較高，達到41.67%。在不同預培養時間內，最適宜的預培養時間為32～48 h，番茄外植體轉化率大幅度提高。番茄外植體經32～48 h的預培養后再進行常規的轉基因操作，此時工程菌細胞對葉芽邊緣的細胞傷口多數形成初愈傷，細胞完整吸附效果好，能明顯提高T-DNA區攜帶的外源目的基因向植物基因組轉化的成功率。

參考文獻：

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[11] LI W Z， CHINNAPPA C C. Isolation and characterization of PHYC gene from Stellaria longipes： Differential expression regulated by different red/far-red light ratios and photoperiods[J].Planta，2004，220（2）： 318-330.endprint

2）菌液生長到OD600 nm為0.3～0.7時，取25～30 mL倒入無菌離心管中，于4 ℃下5 000 r/min離心5 min，去掉上清液，用MS液體培養基將附在離心管壁上的菌液懸浮下來，倒入三角瓶中，27 ℃ 220 r/min搖床內繼續培養。

3）將搖床中的菌液取出，倒入事先放有不同預培養時間番茄葉片的無菌培養皿中，輕微搖勻，浸泡5～8 min。倒出菌液，將葉片夾出在吸水紙（無菌紙）上吸干表面的水分，放在MS液體培養基（含0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA）浸濕的無菌紙上，正面向上，再用無菌紙表面覆蓋一層，用MS液體共培養基封口，放入22 ℃培養箱暗培養。

4）培養3 d后，將材料分別轉至1號篩選培養基（MS固體培養基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +50 mg/L Kan+500 mg/L cb），傷口與培養基充分接觸，27 ℃下光照培養。

5）培養10～15 d統計分化芽數，30 d左右轉至2號篩選培養基（MS固體培養基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +100 mg/L Kan+250 mg/L cb）繼續觀察葉芽的變化，記錄葉芽黃化情況，根據黃化結果計算不同預培養時間番茄外植體的轉化率。

轉化率=未黃化的葉芽數/葉芽總數×100%

2 結果與分析

2.1 番茄愈傷組織培養

含煙草花葉病毒外殼蛋白（TMV-rep）基因的農桿工程菌LBA4404在構建過程中，添加了抗卡那霉素基因，轉化的番茄細胞會表現出對培養基中卡那霉素的抗性，故篩選培養基以卡那霉素濃度為選擇壓力。

從圖1可以看出，侵染后經暗培養的番茄葉片轉入1號篩選培養基后，葉片明顯膨大，葉邊緣傷口處形成大量愈傷組織。1號篩選培養基中羧芐青霉素的濃度較高為500 mg/L，以抑菌為主；而卡那霉素的濃度只有50 mg/L，以篩選轉化細胞為輔。所以葉緣傷口處愈傷組織包含轉化細胞和非轉化細胞，且數量較多。

由圖2可知，番茄愈傷組織轉入2號篩選培養基后，葉緣的愈傷組織出現小部分黃化，因為2號篩選培養基在1號培養基抑菌效果的基礎上降低了羧芐青霉素的濃度，為250 mg/L。減輕羧芐青霉素對愈傷組織生長的抑制作用；卡那霉素的濃度增加到100 mg/L，增加了對非轉化細胞的篩選壓力。少量非轉化細胞在較高的卡那霉素濃度下生長受到抑制，表現為細胞葉綠素減少，葉片愈傷細胞黃化，達到了篩選目的。

由圖3可知，2號培養基篩選后的轉化細胞不受卡那霉素濃度增加的影響，經過一段時間的培養出現生長正常的綠色分化芽，同時還有少量已經分化的芽在后期表現出黃化現象，是非轉化細胞分化后受培養基中高濃度卡那霉素的持續抑制產生的結果。可根據分化芽的黃化數量計算轉化率。

2.2 不同預培養時間對番茄外植體轉化率的影響

從表1可以看出，預培養8 h的番茄外植體轉化率與對照相比有所增加，但增加幅度不大。預培養32～48 h番茄外植體轉化率與對照相比明顯增加，其轉化率均大于70%，差異均達極顯著水平；當預培養時間超過48 h后，轉化率大幅度下降，預培養時間達到56 h時轉化率為0，說明此時番茄葉芽傷口可能已經愈合，這時菌液浸泡葉芽，工程菌細胞質粒中的T-DNA已不能向番茄細胞中轉移。

3 小結

本試驗結果表明，農桿菌介導的外源基因轉化過程中，不經預培養的番茄外植體經葉盤法轉化，轉化率相對較高，達到41.67%。在不同預培養時間內，最適宜的預培養時間為32～48 h，番茄外植體轉化率大幅度提高。番茄外植體經32～48 h的預培養后再進行常規的轉基因操作，此時工程菌細胞對葉芽邊緣的細胞傷口多數形成初愈傷，細胞完整吸附效果好，能明顯提高T-DNA區攜帶的外源目的基因向植物基因組轉化的成功率。

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[6] 律鳳霞，潘永明，郭兆奎.外源RNA干涉基因在煙草中的轉化及表達[J].西北植物學報，2009，29（10）：1962-1966.

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[8] 潘永明.根癌農桿菌介導外源基因轉化番茄體系優化[J].北方園藝，2010（18）：142-144.

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[10] EOM H， LEE C G， JIN E. Gene expression profile analysis in astaxanthin-induced Haematococcus pluvialis using a cDNA microarray[J].Planta，2006，223（6）：1231-1242.

[11] LI W Z， CHINNAPPA C C. Isolation and characterization of PHYC gene from Stellaria longipes： Differential expression regulated by different red/far-red light ratios and photoperiods[J].Planta，2004，220（2）： 318-330.endprint