利用pET—20b克隆與表達多功能半纖維素酶

彭靜靜

摘要：將來源于嗜熱厭氧乙醇菌（Thermoanaerobacter ethanolicus， JW200）的雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB） 構建到pET-20b（+）上，得到質粒pET-20b-xarB。將來源于疏棉狀嗜熱絲孢菌（Thermomyces lanuginosus DSM 5826）木聚糖酶A（XynA）構建到pET-20b-xarB上，得到表達質粒pET-20b-xarB-xynA。將重組質粒pET-20b-xarB-xynA轉入大腸桿菌Escherichia coli JM109（DE3）進行表達。SDS-PAGE結果顯示，該重組酶的分子量為108 kDa，與理論值相符。

關鍵詞：阿拉伯/木糖苷酶；木聚糖酶；pET-20b（+）；多功能半纖維素酶；克隆；表達

中圖分類號：Q785 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）17-4205-03

Cloning and Expression of a Trifunctional Hemicellulase Using pET-20b in Escherichia coli

PENG Jing-jing

（College of Biology and Enology， Taishan University， Taian 271021， Shandong， China）

Abstract： The structure gene from Thermoanaerobacter ethanolicus JW200 encoding arabinosidase-xylosidase XarB gene was amplified and ligated into pET-20b（+）， resulting in pET-20b-xarB. The structure gene from Thermomyces lanuginosus DSM 5826 encoding xylanase（XynA） was amplified and ligated into pET-20b-xarB， resulting in pET-20b-xarB-xynA. The trifunctional enzyme （XarB-XynA） was obtained after expression pET-20b-xarB-xynA in Escherichia coli JM109（DE3）. SDS-PAGE analysis showed that the molecular mass of the expressed recombinant XarB-XynA was about 108 kDa， the same as the predicted size.

Key words： arabinosidase-xylosidase； xylanase； pET-20b（+）；XarB-XynA； cloning； expression

農業廢棄物是指農業生產和農副產品加工后的剩余物，主要包括農作物或果樹的秸稈或枝條、果實外殼、玉米芯、甘蔗渣等，其主要化學成分是纖維素、半纖維素、木質素等，是亟待開發的重要可再生資源。我國每年秸稈產量達6億t左右，目前大部分秸稈用于燃燒或者被廢棄[1]。秸稈中半纖維素的含量占總干重的25%～50%，其化學結構較纖維素復雜，其徹底降解的產物主要是木糖和少量阿拉伯糖、葡萄糖醛酸，可以用作基本碳源生產有機酸、氨基酸、單細胞蛋白、糖醇、工業酶類溶劑或燃劑。

來自嗜熱厭氧乙醇菌（Thermoanaerobacter ethanolicus，JW200）的阿拉伯/木糖苷酶，以人工底物進行測試，其木糖苷酶活性和阿拉伯糖苷酶活性分別為每毫克蛋白質180和1 000 U，高于其他木糖苷酶或阿拉伯糖苷酶的活性[2]。疏棉狀嗜熱絲孢菌（T. lanuginosus DSM 5826）所產生的木聚糖酶A（XynA）屬于G/11家族，具有較好的熱穩定性，在高溫和堿性條件下有效且穩定，沒有纖維素活性，具有工業化應用前景，且研究發現，該木聚糖酶優先降解高聚合度的木聚糖鏈，產物是不同聚合度的低聚木糖，不產生木單糖，這對于生產低聚木糖具有很好的應用價值[3]。同時使用多種克隆的特異水解某一多糖結構的水解酶來降解木聚糖，清潔高效，但工序復雜，成本高。在不改變酶自身優良性質的條件下，如果將有關的水解酶融合串聯成一個具有多種水解酶活性的多功能酶，或通過融合標簽回收重復利用酶，來提高融合酶的綜合效率，這將大大簡化工序并降低成本[4-6]。

本研究采用帶有T7強啟動子的pET系列表達載體，將嗜熱厭氧乙醇菌的雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和來源于疏棉狀嗜熱絲孢菌木聚糖酶A（XynA）進行基因融合，得到多功能酶的融合表達質粒pET-20b-xarB-xynA。通過蛋白質工程構建多功能半纖維素酶（XarB-XynA）來促進生物轉化，為酶法降解半纖維素的工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：E. coli DH10B、E. coli JM109（DE3）（購自Promega公司）。

Luria-Bertani（LB）培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L。固體培養基添加終濃度為2%的瓊脂粉。

含有雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）的重組質粒pHsh-xarB、含有疏棉狀嗜熱絲孢菌 （T. lanuginosus DSM 5826）木聚糖酶A（XynA）基因的質粒pHsh-xynA2由本實驗早期構建并保存。質粒pET-20b（+） （購自Novagen 公司）。endprint

1.2 方法

1.2.1 基因組提取 DNA 操作采用分子克隆技術標準方法進行。質粒轉化采用電轉化方法進行，質粒和PCR產物采用Qiagen plasmid kit 和PCR purification kit（Qiagen USA）進行純化。

1.2.2 基因克隆 根據GenBank中嗜熱厭氧乙醇菌（JW200）雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）的基因序列（GenBank登錄號AF135015）設計引物xarB-N和xarB-C。xarB-N ： 5- CCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAGCCATTATATTTAGAT-3，下劃線為 XbaⅠ酶切位點。xarB-C：5- CCCGATATC TTTATTCTCTACCCTTACTTCC -3，下劃線為 EcoR V酶切位點。以提取的重組質粒pHsh-xarB為模板， 利用相應的上下游引物擴增雙活性阿拉伯/木糖苷酶基因xarB，為提高所擴增片段的保真性，用Pyrobest DNA 酶對模板進行擴增。具體方法見參考文獻[2，3]。所得質粒命名為pET-20b-xarB，雙酶切驗證正確的質粒送上海美吉生物技術公司測序。

根據GenBank中疏棉狀嗜熱絲孢菌（DSM 5826）木聚糖酶A（XynA）基因序列（GenBank 登錄號U35436）以及本試驗優化的pHsh-XynA2的木聚糖酶A（XynA）基因序列，以重組質粒pHsh-xynA2為模板，設計引物xynA-N和xynA-C。xynA-N： 5-CCCGATATCATGCAGACTACCCCGA-3，下劃線為EcoR V酶切位點。xynA-C：5-CCGCTCGAGGCCAACGTCAGCAACA-3，下劃線為為 XhoⅠ酶切位點。

以pHsh-xynA2為模板，利用相應的上下游引物擴增基因xynA，為提高所擴增片段的保真性，用Pyrobest DNA 酶對模板進行擴增。具體方法見參考文獻[2，3]。PCR擴增產物電泳檢測正確后純化，將pET-20b-xarB質粒和PCR擴增純化后的DNA片段分別用EcoR V和XhoⅠ雙酶切，割膠回收DNA片段和載體酶切產物，乙醇沉淀濃縮，16 ℃下連接6～12 h。連接液轉化至E.coli DH10B，挑取陽性克隆，提取質粒用EcoR V和XhoⅠ內切酶酶切驗證，得到重組質粒pET-20b-xarB-xynA，雙酶切驗證正確的質粒送上海美吉生物技術公司測序。

1.2.3 重組蛋白的表達與純化 重組質粒pET-20b-xarB-xynA電轉化到宿主細胞E. coli JM109 （DE3）中，挑取重組單菌落接種于含100 μg/mL的氨芐青霉素的 LB 培養液中培養，至OD600 nm為0.6～0.8，加IPTG至濃度為0.8 mmol/L，繼續培養6 h后，離心收集菌體。用50 mmol/L pH為7.5的 Tris-HCl 緩沖液洗滌細胞2次，并用相同緩沖液重懸細胞，置于冰水浴中用超聲波破碎儀破碎細胞， 超聲條件為50 Hz×15 s×8， 細胞碎片于12 000 r/min 離心10 min，去除上清液即為粗酶液。將粗酶液在60 ℃熱處理30 min后，4 ℃ 12 000 r/min 離心30 min去除變性蛋白。

2 結果與分析

2.1 重組質粒pET-20b-xarB的構建

根據GenBank中嗜熱厭氧乙醇菌（JW200）雙活性阿拉伯/木糖苷酶基因xarB的序列，以重組質粒pHsh-xarB為模板，用引物xarB-N和xarB-C進行PCR擴增，結果如圖1A所示，擴增出來的片段與基因實際大小2 355 bp是相符的。

PCR產物驗證正確后過柱純化，并用XbaⅠ和EcoR V進行雙酶切，酶切后的pET-20b（+）質粒進行連接，得到重組質粒pET-20b-xarB。重組質粒經EcoR V單酶切后釋放出6 000 bp大小的條帶，經XbaⅠ和EcoR V雙酶切后，釋放出2 300 bp大小的條帶，與基因大小一致，同時在3 700 bp處有一條帶和pET-20b（+）載體酶切后條帶大小一致，結果如圖1B所示，測序結果表明基因xarB序列與公布的序列完全一致。

2.2 重組質粒pET-20b-xarB-xynA的構建

以重組質粒pHsh-xynA2為模板，以xynA-N和xynA-C為引物進行PCR擴增，將純化后的DNA片段與pET-20b-xarB分別用EcoR V和XhoⅠ進行

雙酶切，連接后挑選陽性克隆，得到重組質粒pET-20b-xarB-xynA。重組質粒經XhoⅠ單酶切后釋放出6 600 bp大小的條帶，經XbaⅠ和XhoⅠ雙酶切后，釋放出2 955 bp大小的條帶，與基因（xarB+xynA）大小一致，同時在3 700 bp處有一條帶和pET-20b（+）載體酶切后條帶大小一致，酶切結果如圖2所示。

2.3 重組多功能半纖維素酶的表達及檢測

將重組質粒pET-20b-xarB-xynA電轉化到宿主細胞E. coli JM109（DE3）中，挑取重組單菌落接種于含100 g/mL 的氨芐青霉素的 LB 培養液中培養至OD600 nm為0.6～0.8，加IPTG至濃度為0.8 mmol/L，繼續培養6 h 后，離心收集菌體。以pET-20b（+）轉化產物為對照，SDS-PAGE分析結果表明，重組菌均能產生約108 kDa的特異條帶，結果如圖3所示，與預期的蛋白質相對分子量大小一致。

3 討論

雖然已有多種木聚糖酶被提純或基因克隆，并且這些酶在底物特異性熱穩定性及酶反應的底物范圍等性能方面都各有優勢，但是相對于半纖維素結構及其降解的復雜特點，僅靠自然菌種所產酶的單一優良性質仍不能實現農業廢棄物的高效利用，也不能滿足工業生產的需要。重組酶XarB這個雙重活性的酶可與木聚糖酶協同作用徹底降解阿拉伯木聚糖，是工業酶制劑的理想酶源，從而為構建多功能半纖維素融合酶提供一個很好的酶材料。endprint

本研究將來源于嗜熱厭氧乙醇菌雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和來源于疏棉狀嗜熱絲孢菌木聚糖酶A（XynA）同時構建到pET-20b（+）上，得到融合酶表達質粒pET-20b-xarB-xynA，并且在大腸桿菌里面成功表達。雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和木聚糖酶（XynA）融合后所得的雜合酶在降解農業廢棄物方面有著明顯的優勢，將有助于提高農業廢棄物的降解效率。

參考文獻：

[1] BASTAWDE K B. Xylan structure， microbial xylanase， and their mode of action[J]. World J Microbiol Biotechnol，1992，8：353-368.

[2] YIN E K， LE Y L， PEI J J， et al. High-level expression of the xylanase from Thermomyces lanuginosus in Escherichia coli [J]. World J Microbiol Biotechnol， 2008， 24： 275-280.

[3] XUE Y M， LU C， MAO Z G， et al. Cloning and expression of arabinofuranosi-dase/xylosidase gene of Thermoanaerobacter ethanolicus in Escherichia coli and stability of expression products[J]. J China Agri Univ， 2003，8（5）：9-13.

[4] LEVASSEUR A， NAVARRO D， PUNT P J， et al. Construction of engineered bifunctional enzymes and their overproduction in Aspergillus niger for improved enzymatic tools to degrade agricultural by-products[J]. Appl Environ Microbiol， 2005， 71（12）： 8132-8140.

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本研究將來源于嗜熱厭氧乙醇菌雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和來源于疏棉狀嗜熱絲孢菌木聚糖酶A（XynA）同時構建到pET-20b（+）上，得到融合酶表達質粒pET-20b-xarB-xynA，并且在大腸桿菌里面成功表達。雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和木聚糖酶（XynA）融合后所得的雜合酶在降解農業廢棄物方面有著明顯的優勢，將有助于提高農業廢棄物的降解效率。

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本研究將來源于嗜熱厭氧乙醇菌雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和來源于疏棉狀嗜熱絲孢菌木聚糖酶A（XynA）同時構建到pET-20b（+）上，得到融合酶表達質粒pET-20b-xarB-xynA，并且在大腸桿菌里面成功表達。雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和木聚糖酶（XynA）融合后所得的雜合酶在降解農業廢棄物方面有著明顯的優勢，將有助于提高農業廢棄物的降解效率。

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