瞬時外向鉀電流在糖尿病心肌病電重構(gòu)中的作用

劉星+張良勝+諸波+査克嵐+張雪梅+楊悠+范忠才

[摘要] 目的 探討糖尿病心肌病（DCM）大鼠心室肌細胞瞬時外向鉀電流（Ito）的變化，了解其在電重構(gòu)中的作用。方法 選用20只健康成年SD大鼠，隨機分為對照組（n=10）和DCM組（n=10），并通過病理組織學證實為DCM心肌病理學改變。分別對兩組大鼠采用改進的耐鈣成年大鼠急性酶分離方法分離心肌細胞，運用膜片鉗技術(shù)以全細胞模式分別記錄兩組大鼠心室肌單細胞的Ito和膜電容，并分析比較兩組大鼠心室肌Ito的變化。 結(jié)果 與對照組比較，DCM組大鼠左心室心肌細胞的Ito電流密度顯著低于對照組[+70 mV時，（16.80±9.10） pA/pF vs （36.25±5.20） pA/pF]（P<0.05），DCM組的Ito的I-V曲線明顯較對照組下移。 結(jié)論 DCM的Ito數(shù)量明顯減少，在DCM心肌電重構(gòu)中起著重要作用。Ito的減少及Ito通道的分布密度不同，可導致動作電位時程與有效不應期發(fā)生變化，可能與臨床嚴重心律失常的發(fā)生有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 糖尿病心肌病；電重構(gòu)；膜片鉗；瞬時外向鉀電流

[中圖分類號] R587.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）09（a）-0004-05

Effect of transient outward potassium current on ventricular electrophysiological remodeling in diabetic cardiomyopathy

LIU Xing1 ZHANG Liang-sheng2 ZHU Bo1 ZHA Ke-lan1 ZHANG Xue-mei1 YANG You1 FAN Zhon-cai1▲

1.Department of Cardiology，the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College，Luzhou 646000，China；2.Department of Cardiology，People′s Hospital of Yongcheng City in Henan Province，Yongcheng 476600，China

[Abstract] Objective To investigate the changes of the transient outward potassium current （Ito） on ventricular myocardium in diabetic cardiomyopathy （DCM） rat and to explore the meaning of theses changes for ventricular electrophysiological remodeling. Methods 20 healthy adult Spprague-dawley rats were selected and randomly divided into control group （n=10） and DCM group （n=10）.The myocardial pathological alterations of DCM were identified in DCM group by histopathologic test，and cardiomyocytes in both groups were separated by advanced calcium-tolerant separation method.Whole-cell path clamp technique was used to record the unicellular changes of Ito and membrane capacitance in left ventricular myocytes for DCM and control group respectively.All data were analysed and compaired by software. Results Compared with control group，the Ito density on left ventricular myocytes was significantly lower in DCM group than that of the control group [（16.80±9.10） pA/pF vs （36.25±5.20） pA/pF，at +70 mV]（P<0.05），and the I-V curve of Ito in DCM group was more depressed than the control group markedly. Conclusion The changes of Ito play an important role in cardiac electrophysiological remodeling of diabetic cardiomyopathy.The reduction of Ito and the variations of Ito density may be lead to the modifications of action potential duration and effective refractory period，which associates with severe arrthymia.

[Key words] Diabetic cardiomyopathy；Electrophysiological remodeling；Pacth clamp；Transient outward potassium current

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是指由糖尿病引起的心臟微血管病變、心肌代謝紊亂和心肌纖維化，最終引起心室肥厚、舒張期和（或）收縮期功能障礙的一種疾病狀態(tài)[1]。DCM是一種特異性心肌病，發(fā)病率高且其潛在患者數(shù)量龐大，極易導致心力衰竭和嚴重心律失常。臨床研究發(fā)現(xiàn)，DCM嚴重心律失常的發(fā)生率非常高，其一旦發(fā)生不僅惡化心功能，加重心肌損傷，而且極易導致患者死亡。目前多數(shù)學者認為DCM惡性心律失常的發(fā)生與心室肌離子流及其通道改變即電重構(gòu)現(xiàn)象有關(guān)。瞬時外向鉀電流（Ito）是心肌細胞上發(fā)現(xiàn)較早的離子流，對于心肌細胞1期復極及平臺期形成有重要影響；同時Ito在心內(nèi)、外膜心肌上的正常分布密度可維持其正常的動作電位時程（active potential duration，APD）離散度，從而起到維持心肌電穩(wěn)定的作用。一旦Ito發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能以及分布的紊亂極易導致心肌的電學改變，臨床上可表現(xiàn)為心律失常。本研究通過鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）腹腔注射建立大鼠DCM模型，利用膜片鉗技術(shù)檢測心室肌細胞Ito的變化，以明確Ito電流在DCM心室電重構(gòu)中的變化情況，從而了解其在電重構(gòu)中的作用，有助于闡明DCM心室電重構(gòu)的發(fā)生機制及其與心律失常的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SD成年大鼠20只，清潔級，雌雄不拘，體重180～220 g，購于第三軍醫(yī)大學醫(yī)學實驗動物中心。實驗中對動物處置符合動物倫理學標準。

1.2 試劑與主要儀器

1.2.1 主要試劑 膠原酶Ⅱ，血清白蛋白，牛磺酸，乙二醇雙四乙酸（EGTA），羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），谷氨酸，氯化鈷，STZ，天冬氨酸鉀。均為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2.2 主要儀器 膜片鉗放大器（CEZ-2300，Nihon konden，Japan）；A/D轉(zhuǎn)換器（Digidata 1322A，Axon Instruments，USA）；倒置相差顯微鏡（Axivert-135，Zeiss，Germany）；三維操縱器（WN 203，Narishige，Japan）；電極經(jīng)橫式拉制機（P-97 sutter，USA）；體視顯微鏡（S8APO，LEICA，Germany）；Langendorff灌流裝置（ML176，Austrilia）等。

1.3 實驗方法

1.3.1 DCM大鼠造模 將20只SD大鼠隨機分為對照組（n=10）和DCM組（n=10），對照組始終以普通飼料喂養(yǎng)，DCM組以高脂飲食喂養(yǎng)（20%蔗糖、10%豬油、10%蛋黃粉，0.5%膽固醇和59.5%基礎(chǔ)飼料）。喂養(yǎng)至第6周DCM組以1%STZ 30 mg/kg腹腔注射，對照組以同體積枸櫞酸緩沖液一次性腹腔注射。72 h后尾靜脈取血測空腹血糖，血糖≥11.1 mmol/L判斷為2型糖尿病造模結(jié)束。對照組普通飼料喂養(yǎng)6周，DCM組高脂高糖飼料喂養(yǎng)6周[1-2]。

1.3.2 分離心肌細胞 將無鈣臺氏液、KB液和酶液分別用95%O2和5%CO2飽和30 min，打開與Langendorff相連的恒溫浴槽相連，檢測溫度為37℃。用去離子水沖洗Langendorff系統(tǒng)10 min。用3%戊巴比妥鈉0.2 ml/100 g，肝素4 U/g對SD大鼠腹腔注射。麻醉成功后，剪開大鼠胸腔，迅速取出心臟后置于4℃無鈣臺氏液中，輕輕擠壓心臟排出殘血，經(jīng)主動脈逆行插管，固定于Langendorff灌流裝置上。先用無鈣臺氏液沖凈殘存在冠狀動脈和心室中的血液，換成消化酶液以8 ml/min持續(xù)灌流6～7 min，然后每隔1 min剪取一小塊左心室組織，共10次，依次裝于盛有KB液的10個小瓶中。將取下的心肌組織塊剪碎，用吸管輕輕吹打，再用200目篩網(wǎng)過濾，得到細胞混懸液，置于氧飽和的KB液保存，室溫下1 h后置于4℃冰箱中備用[3]。

1.3.3 全細胞膜片鉗記錄Ito 取急性酶分離的大鼠心肌細胞，采用全細胞膜片鉗記錄模式記錄電流。選擇細胞膜光滑完整、橫紋清楚、無收縮的細胞，制作形成細胞貼附式膜片（cell-attached patch），在此基礎(chǔ)上，向微電極內(nèi)給予較強的負壓形成全細胞記錄構(gòu)型。最后施以Ito電流刺激方案，引導出Ito電流刺激波形。本實驗使用膜片鉗放大器（CEZ-2300，Nihon konden，Japan）記錄電流信號，經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換器（Digidata 1322A，Axon Instruments，USA）處理后，用Clampex（version 10.1）軟件系統(tǒng)采集后儲存于計算機中。采樣頻率為10 kHz，采樣方式為Clampex下的Episodic stimulation[4-5]。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用Originpro 8.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌細胞的細胞活性

鏡下可見兩種細胞：一種為死亡細胞，細胞攣縮，呈圓形或者橢圓形，橫紋消失，細胞溶解，細胞膜破裂；另一種細胞為存活心肌，呈桿狀或矩形，橫紋清晰，表面干凈，折光性好，立體感強（圖1箭頭）。

圖1 分離的心室肌細胞（箭頭所指）

2.2 病理切片觀察結(jié)果

隨機抽取對照組及DCM組各兩只大鼠作病理切片檢查，結(jié)果對照組心肌纖維排列整齊，可見橫紋，胞質(zhì)豐富，細胞間隙正常（圖2）。DCM組心肌細胞呈空泡狀，排列紊亂、扭曲，部分心肌纖維斷裂、壞死，壞死心肌由纖維組織替代，符合DCM心肌病理變化（圖3）。

圖2 對照組左室心肌細胞HE染色（×400）

圖3 DCM組左室心肌細胞HE染色（×400）

2.3 心室肌細胞Ito的變化

保持電位于-80 mV下，以10 mV為階躍，自-50 mV除極至+70 mV，鉗制時間為300 ms引出Ito（圖4～圖6）。通過記錄將Ito的電流強度、膜電容、電流密度進行分析。

圖4 DCM組左心室肌細胞Ito

圖5 對照組左心室肌細胞Ito

圖6 Ito的刺激方案

2.3.1 膜電容 DCM組心室肌膜電容為（59.92±15.96） pF，對照組的膜電容為（58.75±16.41） pF，兩組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（圖7）。

圖7 DCM組與對照組左心室肌細胞膜電容

2.3.2 電流密度 -40～-20 mV，DCM組Ito密度略高于對照組（P>0.05）；在鉗制電位-10～+70 mV，DCM組Ito密度低于對照組（P<0.05），且隨鉗制電位增加差異性越顯著，當指令電壓達到+70 mV時，DCM組電流密度為（16.80±9.10） pA/pF，而對照組達（36.25±5.20） pA/pF，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表1）。

表1 DCM組與對照組大鼠心肌細胞Ito的電流密度（pA/pF，x±s）

與對照組比較，*P<0.05

2.3.3 I-V曲線 DCM組和對照組的I-V曲線均呈線性依賴性，為內(nèi)向整流特性，指令電壓-50～-20 mV，電流幅度增加不明顯，兩組曲線走向平緩。指令電壓 -20～+70 mV，對照組電流增幅較大，而DCM組增幅較小，DCM組明顯較對照組下移，尤其是在指令電壓 +10 mV以后更為明顯（圖8）。

圖8 對照組與DCM組心室肌細胞Ito的I-V曲線

3 討論

1974年Hamby等首次提出DCM的概念，指由糖尿病引起心臟微血管病變、肌代謝紊亂和心肌纖維化等所致的心肌廣泛結(jié)構(gòu)異常，最終引起左心室肥厚、舒張期和（或）收縮期功能障礙的一種疾病狀態(tài)[6]。糖尿病及其并發(fā)的DCM容易導致心力衰竭和多種心律失常。大量研究顯示，糖尿病是心房顫動的獨立高危因子[7-8]；糖尿病患者極易發(fā)生室性心律失常及猝死[9-10]，嚴重威脅著人類的生命健康。然而目前對這類受損心肌發(fā)生心律失常的機制尚不甚清楚。以往大量的研究已經(jīng)證實心律失常的發(fā)生與細胞內(nèi)外離子流以及相關(guān)離子通道的變化即電重構(gòu)密切相關(guān)。因此，明確DCM心肌細胞是否存在電重構(gòu)，以及相關(guān)的離子及通道發(fā)生了怎樣的改變意義重大，有助于闡明DCM發(fā)生心律失常的電生理機制。

在心肌細胞，鉀離子（K+）直接參與心肌電興奮的恢復過程，對APD的長短具有決定性作用，故K+濃度及K+通道的變化是導致嚴重心律失常的重要因素之一。細胞內(nèi)K+濃度的變化主要依賴于細胞內(nèi)的K+外流，其中Ito在APD 0相時被激活并參與了APD 1相復極過程。Ito是心肌細胞上發(fā)現(xiàn)較早的離子流，包含兩種成分：Ito1與Ito2。它們的發(fā)生機制不同，Ito1是對4-APD敏感的（SH族），后者是Ca2+依賴性的（SLO族），但在分子結(jié)構(gòu)上均由4個α螺旋亞單位構(gòu)成。Ito2情況復雜，研究較少，一般Ito均指Ito1。Ito1對2相APD的起始水平起決定性作用，調(diào)節(jié)L-Ca2+通道及Na+-Ca2+交換的活性，影響APD[11]。在大鼠和人類心肌細胞上Ito電流很強，電生理特性相似[12]。在大鼠和人類心室肌記錄到動作電位1期的切跡是由Ito引起的，Ito對于1期復極及平臺期形成有重要影響。若Ito很強，APD呈三角形，APD縮短；反之Ito減弱，平臺期延長，APD延長。有報道認為Ito減弱，使心室復極延長，可引發(fā)各種心律失常[13]。Ito不同的分布密度比例會使心外膜與心內(nèi)膜APD不同，從而使心臟APD離散度增加，引起各向異質(zhì)性，導致折返性心律失常。Ito相關(guān)的鉀通道主要有KV1.4、KV4.2和KV4.3，在不同的哺乳動物，三種通道分布不同[14]。在人類KV4.3對Ito形成起主要作用[15]，KV1.4有少量表達。有研究表明，心力衰竭時KV4.3在心肌的表達量明顯下降，而KV1.4表達則上升，并在不同的部位上升的幅度不同，這可能對心室肌Ito分布密度梯度的形成有主要作用[16]。因此，研究Ito在電重構(gòu)中的作用有重要意義。

本課題通過對兩組大鼠心肌細胞Ito的記錄及分析顯示，在電壓為+70 mV時，DCM組的電流密度較對照組明顯降低（P<0.05），從I-V曲線看，DCM組較對照組下移明顯。該結(jié)果證實了在DCM心室肌細胞存在Ito的明顯變化，這可能是導致其心室電重構(gòu)的重要離子變化，產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能是：①DCM心室肌細胞Ito開放數(shù)目減少或通道開放受抑制；②DCM心肌細胞廣泛水腫，導致細胞膜電容增大，Ito電流相對減小。根據(jù)本實驗結(jié)果及其他學者相關(guān)研究，認為在DCM的電重構(gòu)可能表現(xiàn)如下：①在DCM發(fā)病過程中，心室肌細胞Ito減小，引起1相復極速度減慢，平臺期延長，有效不應期和APD延長，整個復極時間延長，發(fā)生后除極，發(fā)生心律失常；②Ito不同的分布密度比例，心內(nèi)膜與心外膜APD不同，動作電位離散度增加，引起各向異質(zhì)性，形成折返，在臨床上表現(xiàn)為各種心律失常，如室性心動過速、心室顫動等。

綜上所述，DCM心肌細胞存在電重構(gòu)，Ito在其中扮演著重要角色，進一步充分深入研究該離子通道的改變及相關(guān)影響因素，將有助于闡明DCM電重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展機制及其與心律失常的關(guān)系，從而為不久的將來臨床防治DCM心律失常提供新的方法奠定理論基礎(chǔ)。

[參考文獻]

[1] 董世芬，洪纓，樊江波，等.實驗性2型糖尿病心肌病大鼠模型的建立與評價[J].中國實驗動物學報，2009，7（4）：245-251.

[2] 鄭彩虹，郭志新.2型糖尿病大鼠心臟組織MCP-1表達及替米沙坦對其影響[J].中國醫(yī)療前沿，2008，3（22）：20-22.

[3] Isenberg G，Klockner U.Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium"[J].Pflugers Arch，1982，395（1）：6-18.

[4] 王華，曾曉榮.細胞內(nèi)鈣濃度變化對心房肌小電導鈣激活鉀通道電流的影響[D].瀘州：瀘州醫(yī)學院，2012.

[5] 劉振偉.實用膜片鉗技術(shù)[M].北京：軍事醫(yī)學科學出版社，2006：90-103.

[6] Resl M，Hülsmann M，Pacher R，et al.Heart failure in diabetes[J].Wien Med Wochenschr，2009，159（5-6）：134-140.

[7] Nichols GA，Reinier K，Chugh SS.Idependent contribution of diabetes to increased prevalence and incidence of atrial fibrillation[J].Diabetes Care，2009，32（10）：1851-1856.

[8] Huxley RR，Alonso A，Lopez FL，et al.Type 2 diabetes，glucose homeostasis and incident atrial fibrillation：the Atherosclerosis Risk in Communities study[J].Heart，2012， 98（2）：133-138.

[9] Vinik AI，Maser RE，Ziegler D.Autonomic imbalance：prophet of doom or scope for hope？[J].Diabet Med，2011， 28（6）：643-651.

[10] Vinik AI，Ziegler D.Diabetic cardiovascular autonomic neuropathy[J].Circulation，2007，115（3）：387-397.

[11] Grant AO.Cardiac ion channels[J].Circ Arrhythm Electrophysiol，2009，2（2）：185-194.

[12] Tomita F，Bassett AL，Myerburg RJ，et al.Diminished transient outward currents in rat hypertrophied ventricular myocytes[J].Circ Res，1994，75（2）：296-303.

[13] Bryant SM，Shipsey SJ，Hart G.Normal regional distribution of membrance current density in rat left ventricle is altered in catecholamine-indnced hypemphy[J].Cardiovasc Res，1999，42（2）：391-401.

[14] Wickenden AD，Jegla TJ，Kaprielian R，et al.Regional contributions of Kv1.4，Kv4.2，and Kv4.3 to transient outward K+ current in rat ventricle[J].Am J Physiol，1999， 276（5 Pt 2）：H1599-H1607.

[15] Nerbonne JM，Kass RS.Molecular physiology of cardiac repolarization[J].Physiol Rev，2005，85（4）：1205-1253.

[16] 李皓，于湘暉，姜春來，等.狗Ito相關(guān)通道離子通道表達分析[J].中國生物制品學雜志，2006，19（1）：8-11.

（收稿日期：2014-07-15 本文編輯：郭靜娟）

[3] Isenberg G，Klockner U.Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium"[J].Pflugers Arch，1982，395（1）：6-18.

[4] 王華，曾曉榮.細胞內(nèi)鈣濃度變化對心房肌小電導鈣激活鉀通道電流的影響[D].瀘州：瀘州醫(yī)學院，2012.

[5] 劉振偉.實用膜片鉗技術(shù)[M].北京：軍事醫(yī)學科學出版社，2006：90-103.

[6] Resl M，Hülsmann M，Pacher R，et al.Heart failure in diabetes[J].Wien Med Wochenschr，2009，159（5-6）：134-140.

[7] Nichols GA，Reinier K，Chugh SS.Idependent contribution of diabetes to increased prevalence and incidence of atrial fibrillation[J].Diabetes Care，2009，32（10）：1851-1856.

[8] Huxley RR，Alonso A，Lopez FL，et al.Type 2 diabetes，glucose homeostasis and incident atrial fibrillation：the Atherosclerosis Risk in Communities study[J].Heart，2012， 98（2）：133-138.

[9] Vinik AI，Maser RE，Ziegler D.Autonomic imbalance：prophet of doom or scope for hope？[J].Diabet Med，2011， 28（6）：643-651.

[10] Vinik AI，Ziegler D.Diabetic cardiovascular autonomic neuropathy[J].Circulation，2007，115（3）：387-397.

[11] Grant AO.Cardiac ion channels[J].Circ Arrhythm Electrophysiol，2009，2（2）：185-194.

[12] Tomita F，Bassett AL，Myerburg RJ，et al.Diminished transient outward currents in rat hypertrophied ventricular myocytes[J].Circ Res，1994，75（2）：296-303.

[13] Bryant SM，Shipsey SJ，Hart G.Normal regional distribution of membrance current density in rat left ventricle is altered in catecholamine-indnced hypemphy[J].Cardiovasc Res，1999，42（2）：391-401.

[14] Wickenden AD，Jegla TJ，Kaprielian R，et al.Regional contributions of Kv1.4，Kv4.2，and Kv4.3 to transient outward K+ current in rat ventricle[J].Am J Physiol，1999， 276（5 Pt 2）：H1599-H1607.

[15] Nerbonne JM，Kass RS.Molecular physiology of cardiac repolarization[J].Physiol Rev，2005，85（4）：1205-1253.

[16] 李皓，于湘暉，姜春來，等.狗Ito相關(guān)通道離子通道表達分析[J].中國生物制品學雜志，2006，19（1）：8-11.

（收稿日期：2014-07-15 本文編輯：郭靜娟）

[3] Isenberg G，Klockner U.Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium"[J].Pflugers Arch，1982，395（1）：6-18.

[4] 王華，曾曉榮.細胞內(nèi)鈣濃度變化對心房肌小電導鈣激活鉀通道電流的影響[D].瀘州：瀘州醫(yī)學院，2012.

[5] 劉振偉.實用膜片鉗技術(shù)[M].北京：軍事醫(yī)學科學出版社，2006：90-103.

[6] Resl M，Hülsmann M，Pacher R，et al.Heart failure in diabetes[J].Wien Med Wochenschr，2009，159（5-6）：134-140.

[7] Nichols GA，Reinier K，Chugh SS.Idependent contribution of diabetes to increased prevalence and incidence of atrial fibrillation[J].Diabetes Care，2009，32（10）：1851-1856.

[8] Huxley RR，Alonso A，Lopez FL，et al.Type 2 diabetes，glucose homeostasis and incident atrial fibrillation：the Atherosclerosis Risk in Communities study[J].Heart，2012， 98（2）：133-138.

[9] Vinik AI，Maser RE，Ziegler D.Autonomic imbalance：prophet of doom or scope for hope？[J].Diabet Med，2011， 28（6）：643-651.

[10] Vinik AI，Ziegler D.Diabetic cardiovascular autonomic neuropathy[J].Circulation，2007，115（3）：387-397.

[11] Grant AO.Cardiac ion channels[J].Circ Arrhythm Electrophysiol，2009，2（2）：185-194.

[12] Tomita F，Bassett AL，Myerburg RJ，et al.Diminished transient outward currents in rat hypertrophied ventricular myocytes[J].Circ Res，1994，75（2）：296-303.

[13] Bryant SM，Shipsey SJ，Hart G.Normal regional distribution of membrance current density in rat left ventricle is altered in catecholamine-indnced hypemphy[J].Cardiovasc Res，1999，42（2）：391-401.

[14] Wickenden AD，Jegla TJ，Kaprielian R，et al.Regional contributions of Kv1.4，Kv4.2，and Kv4.3 to transient outward K+ current in rat ventricle[J].Am J Physiol，1999， 276（5 Pt 2）：H1599-H1607.

[15] Nerbonne JM，Kass RS.Molecular physiology of cardiac repolarization[J].Physiol Rev，2005，85（4）：1205-1253.

[16] 李皓，于湘暉，姜春來，等.狗Ito相關(guān)通道離子通道表達分析[J].中國生物制品學雜志，2006，19（1）：8-11.

（收稿日期：2014-07-15 本文編輯：郭靜娟）