乙型肝炎病毒表面抗原特異性結合肽的篩選與鑒定＊

孫 鳴，馬智勇，黃朝陽，胡 斌△，沈關心（1．廈門大學附屬第一醫院生殖醫學科，福建

廈門 361003；2．華中科技大學同濟醫學院免疫學系，湖北武漢 430030；3．廈門大學附屬第一醫院檢驗科，福建廈門 361003）

乙型肝炎病毒（HBV）是一種嗜肝DNA病毒，是導致人類急性和慢性乙型肝炎的主要原因。目前在乙型肝炎治療方面，基于RNA干擾的基因治療成為HBV感染者新的治療策略［1－5］。但是，如何將siRNA或siRNA表達盒靶向導入 HBV感染的肝細胞是目前應用RNA干擾治療HBV感染的主要難題之一［6］。乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）表達于HBV感染的肝細胞表面，而未感染的肝細胞不表達此抗原，是HBV基因治療的良好靶分子［4］。噬菌體展示技術是將外源的重組肽、蛋白質包括抗體片段融合到噬菌體衣殼蛋白上的一項基因技術，是篩選特定分子、細胞甚至組織特異性小分子多肽的有利工具。本研究以HBsAg作為靶物質，應用噬菌體展示肽庫技術篩選可以與HBsAg特異性結合的短肽序列，期望以此短肽為橋梁介導siRNA分子結合HBV感染的肝細胞，為乙型肝炎的靶向基因治療研究奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 材料來源 Ph．D．－12TM 噬菌體隨機肽庫購自 New England Biolabs公司（E8111L），庫濃度為1．0×1013pfu／mL，宿主 菌 為 E．coli2738，－96gⅢ 自 動 測 序 引 物 （5′－CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG－3′）由上海生物工程技術有限公司合成。試劑：HRP標記的抗 M13蛋白Ⅷ單克隆抗體（＃27－9421－01，anti－M13phageⅧ，1∶5 000稀釋工作濃度）購自 GE healthcare公司。酵母表達的HBsAg由武漢生物制品研究所饋贈。

1．2 方法

1．2．1 噬菌體隨機肽庫篩選結合HBsAg的特異性多肽 將酵母表達的 HBsAg抗原用0．1mol／L碳酸氫鈉（NaHCO3，pH 8．6）包被緩沖液稀釋成70μg／mL，每孔100μL包被96微孔板，4℃孵育過夜。倒掉包被液，每孔加滿封阻液［0．1mol／L NaHCO3，5mg／mL牛血清清蛋白（BSA），0．02%的 NaN3］，4℃封阻2h。用 TBST（50mmol／L Tris－HCl，150mmol／L NaCl，0．1%Tween－20）快速洗板6次，每孔加入1．0×1011pfu的噬菌體，室溫輕搖震蕩60min，棄去未結合的噬菌體液，用TBST洗板10次，每孔加入非特異性鹽酸甘氨酸洗脫液（0．2 mol／L Glycine－HCl，pH 2．2，1mg／mL BSA）100μL，室溫輕搖10min，洗脫特異性結合的噬菌體，收集洗脫液于微量離心管，加入中和緩沖液15μL（1mol／L Tris－HCl，pH 9．1），留取5μL用于滴度測定，剩余洗脫物感染宿主菌ER2738進行擴增，回收后測滴度用于下一輪篩選。以上述方法進行后面3輪篩選，使結合HBsAg的噬菌體克隆得到富集。

1．2．2 特異性結合HBsAg的噬菌體克隆測序 經4輪篩選后，隨機挑取15個噬菌體克隆，提取DNA送公司測序。具體操作如下：將單個噬菌體克隆加入1mL ER2738培養物中進行小量擴增，取擴增液500μL，加入200μL PEG／NaCl，混勻，室溫放置10min；10 000r／min，離心10min，棄上清液，加100 μL碘化物緩沖液（10mmol／L Tris－HCl，pH 8．0，1mmol／L EDTA，4mol／L NaI）和250μL無水乙醇懸浮沉淀，室溫溫育10min；10 000r／min，離心10min，棄上清液，用70%乙醇500 μL洗沉淀，再離心去上清液并晾干沉淀，滅菌超純水30μL懸浮即得高質量的噬菌體克隆DNA。瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用肽庫－96gⅢ自動測序引物送上海生物工程技術有限公司測序。

1．2．3 ELISA鑒定特異性結合HBsAg多肽的親和力 用包被緩沖液將HBsAg稀釋成20μg／mL，以每孔100μL包被微孔板，密封濕盒中4℃過夜。棄包被液，每孔加滿封阻液，4℃封阻2h。0．5%TBST洗板6次，然后按所測定的噬菌體滴度每孔加人5．0×1010pfu的噬菌體，室溫作用2h，0．5%Tween－20TBST洗板6次，再加入 HRP標記的anti－M13phageⅧ（1∶5 000）抗體，作用1h，0．5%Tween－20TBST洗板6次，加入TMB顯色液和終止液。以酶標儀讀取A450值。同時以20μg／mL BSA 100μL包被微孔板作無關蛋白對照。

1．2．4 劑量依賴結合實驗鑒定特異性結合HBsAg多肽的特異性 將HBsAg和無關蛋白m1ECD（小鼠肝臟去唾液酸糖蛋白受體大亞基胞外段）以不同濃度（1、2．5、10、40、70μg／mL）每孔100μL包被微孔板，4℃孵育過夜，并用封阻液4℃封閉2h，0．5%TBST 洗板6次。每孔加入5．0×1010pfu的 No．3號噬菌體和原庫，室溫作用2h，0．5%Tween－20TBST洗板6次，再加入 HRP標記的anti－M13phageⅧ（1∶5 000）抗體，作用1h，0．5%Tween－20TBST洗板6次，加入 TMB顯色液和終止液。以酶標儀讀取A450值。

1．2．5 競爭抑制實驗鑒定特異性結合HBsAg多肽的特異性 按上述方法用20μg／mL HBsAg每孔100μL包被微孔板。將不同濃度140、70、40、20、10μg／mL 的 HBsAg取100 μL與1．0×1010pfu No．3號噬菌體上清液混勻，室溫作用2h。混勻物加入HBsAg包被微孔板內，室溫震蕩2h，0．5%TBST洗板6次，加入HRP標記的anti－M13phageⅧ（1∶5 000）抗體孵育1h，再用0．5%TBST洗板6次，加入TMB顯色液和終止液。以酶標儀讀取A450值。

1．3 儀器與試劑 TMB ELISA顯色液和終止液購自上海科華生物技術有限公司。其他試劑均為本室配置。主要儀器：高速離心機（Beckman JA－25．50）、低溫離心機（Sigma 3－16K）、酶標儀（Thermo multiskan MK3）等。

2 結 果

2．1 特異性結合HBsAg多肽的篩選 以酵母表達的HBsAg作為靶分子，對噬菌體十二肽庫進行了4輪篩選，第4輪回收率（回收／投入）比第1輪增加了20倍（表1）。又進行了輪次ELISA鑒定，用ELISA鑒定每輪洗脫物擴增后對HBsAg親和力的增加，與HBsAg結合的噬菌體得到了有效的富集，見圖1。

表1 從噬菌體十二肽庫篩選HBsAg結合肽

圖1 各輪洗脫物擴增后對HBsAg的結合

2．2 特異性結合HBsAg的噬菌體克隆測序 第4輪篩選完成后，從洗脫物測滴度平板隨機挑取15個克隆，提取噬菌體DNA并送測序。結果顯示存在9種多肽序列No．1～No．9，其中No．1～No．3為優勢序列。見表2。

表2 噬菌體克隆展示肽測序結果

2．3 ELISA鑒定特異性結合HBsAg多肽的親和力 擴增No．1～No．9噬菌體，以噬菌體ELISA實驗檢測它們與HB－sAg的結合情況，優勢克隆No．3與HBsAg結合最強。結果見圖2。

圖2 No．1～No．9噬菌體的ELISA鑒定

2．4 劑量依賴結合實驗鑒定特異性結合HBsAg多肽的特異性 No．3號噬菌體與HBsAg的結合，隨著HBsAg包被濃度的增加而增加，而與無關蛋白m1ECD的結合沒有這種劑量依賴性。見圖3。

圖3 No．3號噬菌體與HBsAg的劑量依賴性結合

2．5 競爭抑制實驗鑒定特異性結合HBsAg多肽的特異性游離HBsAg與No．3號噬菌體預先結合后，能夠抑制噬菌體與包被HBsAg的結合，且游離HBsAg濃度越高，抑制作用越強。此外無關蛋白m1ECD對No．3號噬菌體與包被的HB－sAg結合沒有抑制作用。見圖4。

圖4 游離HBsAg對No．3號噬菌體與包被HBsAg結合的抑制

3 討 論

HBV感染是全球重要的公共衛生問題［7］。目前應用于慢性乙型肝炎治療的藥物主要是干擾素和核苷酸類似物，但干擾素因具有明顯的不良反應限制了其長期應用，核苷酸類似物停藥后易發生病毒DNA的反跳和肝功能異常［8］。本研究室和國內外大量實驗表明，RNA干擾（RNAi）可以有效抑制HBV的復制和基因表達，有望成為一種新的HBV感染治療策略［1－5］。但是化學合成的siRNA和質粒或病毒載體表達的shRNA缺乏肝細胞和肝臟的靶向性，限制了RNAi技術在臨床上的應用。如何將siRNA或siRNA表達盒靶向導入HBV感染的肝細胞，是將RNAi技術應用于HBV感染的臨床治療研究必須予以解決的問題之一。目前有多種方法用于細胞靶向的 RNAi，包括細胞表面特異性蛋白的單鏈抗體（scFv）［4，9］、適配子（aptamer）［10］所介導的siRNA導入，以及配體修飾的納米顆粒［11］介導的siRNA導入。它們共同點是找到了細胞特異性的蛋白分子，以此分子為靶標，再通過能與靶標分子特異結合的橋梁分子（如單鏈抗體、適配子等）介導siRNA導入。

小分子多肽具有結構簡單、分子量小、穿透性好、不易引起機體免疫應答等優點，可以作為一種良好的橋梁分子，而噬菌體肽庫展示技術為篩選具有靶向作用的橋梁分子提供了一種有效的工具［12］。本次技術方案是通過噬菌體肽庫展示技術篩選靶向HBV感染肝細胞的靶向性多肽。在靶分子的選擇方面剛開始從兩個方向考慮，一是HBV表達的蛋白分子，優點是特異性強，但表達豐度低；二是肝細胞表面特異性表達的分子，優點是表達豐度高，但特異性一般。最終選取HBsAg為靶分子，HBsAg表達于HBV感染的肝細胞表面且表達豐度較高，未感染的肝細胞不表達此抗原，是靶向HBV感染的肝細胞最特異的靶分子［13］。本研究以酵母表達的HBsAg作為靶物質，對噬菌體隨機十二肽庫進行了4輪篩選，第4輪的回收率比第1輪的回收率增加20倍，輪次ELISA鑒定發現與HBsAg結合的噬菌體得到了有效的富集。隨機挑選了15個噬菌體克隆進行測序，并用ELISA方法檢測各個克隆對HB－sAg的親和力，結果顯示1個展示肽為SSYAPYVWQPIA的優勢噬菌體克隆（No．3號）對HBsAg具有較強的親和力。隨后的HBsAg劑量依賴結合實驗中No．3號噬菌體與HBsAg的結合隨著HBsAg包被量的增加而增加，而與無關蛋白m1ECD的結合沒有這種劑量依賴性，表明No．3號噬菌體與HBsAg的結合是特異性的。進一步的競爭抑制實驗，先用游離HBsAg與No．3號噬菌體預先孵育后，能夠抑制噬菌體與包被HBsAg的結合，且游離的HBsAg濃度越高，抑制作用越強，而無關蛋白m1ECD對No．3號噬菌體與包被的HBsAg結合沒有抑制作用，這個結果進一步證明了該噬菌體展示肽與HBsAg結合是特異性的，因此認為十二肽SSYAPYVWQPIA可以作為橋梁分子用于乙型肝炎的基因治療。

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