人細小病毒B19IgM抗體間接ELISA檢測方法的初步建立＊

凌輝生，儲迅濤，曾敏霞（珠海市麗珠試劑股份有限公司，廣東珠海 519060）

人細小病毒B19（HPV B19）簡稱B19病毒，是1975年Cossort首次發現的一種單鏈線狀小DNA病毒，屬于細小病毒科，是目前細小病毒科中唯一引起人類疾病的病原體。B19病毒能通過胎盤感染胎兒，引起胎兒水腫、自發性流產、死胎和感染性紅斑等多種疾病，對胎兒及嬰幼兒有較大的危害［1－2］；也可通過血液制品的輸注傳染給受血者，成為血液制品的主要污染源之一［3］。因此，研究分析有關HPV B19病毒感染的診斷方法及防治措施，對促進孕婦健康、優生優育及血液制品的安全使用都有重要意義。

1 材料與方法

1．1 標本來源 選擇珠海市婦幼保健院孕婦血清、血漿標本115份及珠海血站健康獻血者血清、血漿樣品共1 700份作為研究材料。HPV B19－IgM陰性血清和陽性血清來自珠海市婦幼保健院。

1．2 試劑與儀器 HPV B19－VP1蛋白購自美國Fitzgerald公司，濃度1．36mg／mL；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗人IgM（使用滴度1∶5 000）和IgG－類風濕因子吸收劑購自深圳菲鵬生物有限公司；對照試劑B19IgM酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自德國維潤賽潤研發有限公司；其他如包被液、封閉液以及顯色系統均為本公司自產；ELISA用96孔酶標板（可拆式）購自廈門怡佳美實驗器材有限公司。

1．3 方法

1．3．1 B19IgM 間接ELISA的建立 棋盤法進行間接ELISA最佳試劑工作條件的確定。（1）包被：以系列濃度的包被抗原（1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000）包被酶標板，2～8℃孵育過夜，次日，棄去孔內溶液，洗滌；（2）封閉：每孔封閉液120μL，37℃條件下孵育3h，洗滌；（3）加入待檢血清（經IgG－類風濕因子吸收劑處理），100微升／孔，37℃孵育60min；洗滌；（4）加酶標二抗：將酶標二抗分別稀釋至1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000，加入上述反應孔中，37℃孵育30min，洗滌；（5）底物顯色：于各反應孔中加入底物緩沖液、底物液各50μL，37℃孵育15min；（6）終止反應：于各反應孔中加入終止液50μL；（7）A450／630值測定，由陽性／陰性（P／N）值選擇最佳抗原包被濃度和酶標二抗的最佳工作濃度。

1．3．2 重組蛋白 HPV B19－VP1包被方式的確定 將重組HPV B19－VP1蛋白用包被緩沖液稀釋至最佳濃度后，分別采用37℃孵育60、120、180min和2～8℃過夜包被處理，進行試驗，根據結果計算P／N值，選擇最佳包被條件。

1．3．3 IgG－類風濕因子吸收劑使用量的確定 按上步試驗確定的抗原包被濃度及酶標記物濃度，IgG－類風濕因子按不同比例使用，選擇合適的IgG－類風濕因子吸收劑使用量以及IgG－類風濕因子吸收劑的最適作用時間和最適反應溫度。

1．3．4 酶標二抗最佳工作時間的確定 將酶標二抗稀釋至最佳工作濃度后，每孔加入100μL，于37℃分別孵育10、20、30、40、50、60min，每個反應重復2次。其他條件及操作方法相同，進行試驗。

1．3．5 底物顯色時間的確定 按已確定的包被濃度、酶標記物濃度及酶標記物反應時間；控制底物顯色時間分別為30、25、20、15、10、5min，選擇適當的底物顯色時間。

1．3．6 臨界值的確定 用建立的間接ELISA方法檢測500份HPV B19－IgM陰性血清，對A450／630值進行頻數分布分析，確定陰性均值）和標準差（s），以＋2s）計算臨界值。

1．4 間接ELISA檢測方法性能評價 （1）敏感性試驗：將5份HPV B19－IgM陽性血清和1份陰性血清分別作1∶100、1∶200、1∶400、1∶600、1∶800、1∶1 000稀釋，用已建立的ELISA方法檢測。（2）重復性試驗：對包括陰性血清在內的4份樣品進行3批批內和3次批間重復性試驗，測定A450／630值，計算每份血清A450／630值的和s，以確定批內和批間試驗的變異系數（CV）。（3）臨床樣品的檢測：應用本試驗建立的間接ELISA檢測方法檢測1 700份健康獻血者血清、115份孕婦血清的HPV B19－IgM抗體，以對照試劑盒檢測結果為參考進行比較分析。

2 結 果

2．1 最佳包被濃度和酶標二抗工作濃度的確定 選定陽性血清的A450／630值1．0左右，且P／N值最大反應孔的抗原及酶標二抗的稀釋倍數作為二者最佳的稀釋倍數。故抗原稀釋倍數為1∶2 000和酶標二抗稀釋倍數為1∶2 000時，陽性血清A450／630值較大（1．031），且P／N值最大（19．453），因此抗原最佳包被滴度為1∶2 000，而最佳酶標二抗工作滴度為1∶2 000。見表1。

2．2 最佳包被條件的確定 以最佳包被濃度包被后，分別37℃包被60、120、180min和2～8℃包被過夜，包被后進行試驗，結果顯示當包被條件為2～8℃過夜時P／N值最大，因此確定最佳包被條件為2～8℃包被過夜。

2．3 IgG－類風濕因子吸收劑最佳使用量的確定 按照操作程序，樣品經IgG－類風濕因子吸收劑處理時，其陽性質控品的A值明顯下降，說明特異性IgG存在會影響IgM的測定，而加入IgG－類風濕因子吸收劑可以去除特異性IgG的干擾；當IgG－類風濕因子吸收劑和樣品的比例在1∶1時，其效果最佳。比例為2∶1時，和比例為1∶1時效果一致。過少的使用量不能完全去除特異性IgG在IgM測定時的干擾，從而影響測定的效果；相同使用比例下，室溫處理30min與2～8℃過夜處理效果一致，均可使用。綜合考慮，樣品最終稀釋比例為1∶102，其模式為：500μL樣品稀釋液＋10μL樣品，取75μL稀釋后樣品＋75μL IgG－類風濕因子吸收劑（1∶1），室溫30min或2～8℃過夜處理。見表2。

2．4 酶標二抗最佳工作時間的確定 從圖1可知，酶標二抗的作用時間為30min時，陽性血清A450／630值較大（0．995），且P／N值最大（19．32），因此選擇30min為最佳酶標二抗作用時間。見圖1。

表1 重組蛋白抗原最佳包被濃度與酶標二抗工作濃度的確定

表2 IgG－類風濕因子吸收劑最佳使用量的確定

圖1 不同酶標二抗作用時間時樣品的A450／630值

2．5 底物顯色時間的確定 酶標二抗作用完成后，加入底物液、底物緩沖液顯色，在37 ℃下分別孵育5、10、15、20、25、30 min，加入2mol／L H2SO4溶液終止反應后測定A450／630值，從圖2可見顯色15min時P／N值最高，可作為最佳顯色時間。見圖2。

圖2 不同底物和底物緩沖液作用時間時樣品的A450／630值

2．6 臨界值的確定 對500份HPV B19－IgM陰性血清的A450／630值進行頻數分布分析，其為0．108，s為0．067，臨界值為0．25。

2．7 敏感性試驗 檢測 HPV B19－IgM陽性血清，當血清1∶600稀釋時，檢測結果仍為陽性，所建立的方法具有較好的敏感性。

2．8 重復性試驗 批內CV均值為3．92%，批間CV均值為4．62%，顯示重復性良好，見表3。

表3 重復性試驗結果

2．9 臨床樣品檢測 用本試驗建立的ELISA方法對1 700份健康獻血者血清進行HPV B19－IgM抗體檢測，檢測結果為陽性的血清27份，陽性率為1．59%；與對照試劑檢測結果比較分析，靈敏度為84．60%，特異性為99．70%；符合率為99．47%。對115份孕婦血清HPV B19－IgM抗體檢測，檢測結果為陽性的血清14份，陽性率12．17%；與對照試劑檢測結果比較分析，靈敏度為84．62%，特異性為97．06%；符合率為95．65%，見表4、5。

表4 1 700份健康獻血者血清B19－IgM的比較（n）

表5 115份孕婦血清B19－IgM的比較（n）

3 討 論

B19病毒是一類無包膜的單鏈線狀DNA病毒，其基因組包含5 596個核苷酸，有兩個大的開放閱讀框，左側編碼NS1非結構蛋白（77×103），右側編碼 VP1（84×103）和 VP2（58×103）兩個主要的衣殼蛋白，VP1和VP2組成衣殼包裹在B19病毒DNA表面，構成B19病毒的抗原性，其中96%由VP2組成，VP1僅占4%，B19病毒的主要抗原表位位于VP1獨特區和 VP1－VP2鏈接區［4－5］。雖然 VP1的量比 VP2少，但 VP1大部分片段延伸并暴露在病毒表面，因此更容易與抗體結合，是主要的抗原。VP1獨特區能刺激機體產生中和性抗體，成為診斷試劑和疫苗研究的首選區段［6－7］。

本文選用純化的重組B19病毒VP1蛋白，建立了HPV B19－IgM間接ELISA檢測方法，對1 700份健康獻血者血清進行HPV B19－IgM抗體檢測，檢測結果為陽性的血清27份，陽性率為1．59%。與德國維潤賽潤研發有限公司生產的HPV B19－IgM ELISA試劑盒進行平行比較分析，靈敏度為84．60%，特異性為99．70%，符合率為99．47%。對115份孕婦血清HPV B19－IgM抗體檢測，檢測陽性血清14份，陽性率12．17%，兩種方法有較好的一致性。但其敏感性和特異性稍低，這可能與所用的原核細胞表達系統表達的VP1蛋白空間構象與實際有差異，影響表達蛋白的生物活性。

國外研究報道，B19病毒可通過胎盤垂直傳播，可引起孕婦流產、死胎、胎兒非免疫性水腫等癥狀。在B19病毒感染的流行期，3%～8%的孕婦存在急性感染，胎盤垂直傳播率達33%～51%，在受感染的孕婦中約5%～16%胎兒發病或死亡［8］。國內也有研究報道，在對孕早期婦女血清中B19病毒特異性IgM抗體的篩查發現，HPV B19－IgM陽性率為8．1%，明顯高于TORCH其他幾項病原體的感染率［9］。因此在孕婦及待孕的婦女中開展B19病毒檢測，對于提高妊娠質量具有重要意義。B19病毒可通過血液制品傳播，且難以滅活，使得經過分離處理的血漿制品仍可能遭受污染，有5%～15%的血漿池不能使用，造成損失，因此在獻血者中開展B19病毒檢測，對提高血液制品的質量及提高臨床輸血的安全性意義重大。

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