溶血對時間分辨免疫熒光分析法測定胰島素的影響

謝偉賢，黃澤棋，王曉娟，韓慧明（．廣東省佛山市第二人民醫院檢驗科 58000；．佛山科學技術學院檢藥系，廣東佛山 58000）

體外溶血主要由部分物理性因素所致，包括抽血時負壓過大及標本處理過程中涉及的冰凍、水浴箱溫度過高、機械震蕩等。人體內的胰島素來自于胰島β細胞，外周血胰島素水平可反映胰島素的分泌及代謝速率。外周血胰島素水平檢測對糖尿病的分型及療效評價具有重要作用［1］。紅細胞內含有胰島素降解酶（IDE），溶血可使其從紅細胞內釋放入血清中，降解胰島素，從而影響胰島素水平的檢測［2－3］。本研究選擇不同溶血程度標本，并在溶血后的不同時間段，采用時間分辨免疫熒光分析法進行血清胰島素水平檢測，旨在了解溶血程度和溶血時間對血清胰島素檢測結果影響，以期為指導臨床工作及正確理解溶血對免疫學方法檢測指標的檢測結果的影響奠定基礎［4－6］。

1 材料與方法

1．1 標本來源 本研究涉及的外周血標本采集自佛山市第二人民醫院收治的具有不同胰島素水平的患者30例，包括處于正常參考區間者10例、低于正常參考區間下限者10例、高于正常參考區間上限者10例。所有標本無溶血、黃疸及脂血，并于－80℃條件下保存。

1．2 試劑與儀器 XE－5000全自動血細胞分析儀（日本Sysmex公司），Anytest時間分辨熒光免疫分析儀及配套的胰島素檢測試劑盒（蘇州新波生物技術有限公司）。

1．3 方法

1．3．1 標本處理 從冰箱中取出標本，室溫中復溫、混勻后3 200r／min離心5min，分離血清標本。

1．3．2 血紅蛋白（Hb）標準濃度液的配制 取1 000μL Hb濃度為154g／L的乙二胺四乙酸二鉀抗凝全血，與500μL蒸餾水混勻，－20℃條件下保存24h，即可獲得Hb濃度為100 g／L的標準濃度液。

1．3．3 不同程度溶血標本的制備 根據美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）的文件，將溶血程度分為輕度溶血（血清Hb濃度0～1g／L）、中度溶血（血清Hb濃度為1～5g／L）、重度溶血（血清Hb濃度為大于5g／L）。將分離獲得的血清標本分成990、980、950μL共3管，分別加入10、20、50μL Hb標準濃度液，即可獲得血清Hb濃度分別為1、2、5g／L的溶血標本。

1．3．4 胰島素水平檢測 室溫環境下，于溶血標本配制后0、0．5、2、18h分別進行非溶血標本和溶血標本胰島素水平檢測。操作嚴格按照儀器和試劑盒說明書進行。

1．4 統計學處理 采用SPSS17．0軟件進行數據處理和統計學分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用配對t檢驗，多組間比較采用方差分析或重復測量數據的方差分析，并繪制相應的曲線；P＜0．05為比較差異有統計學意義。

2 結 果

2．1 溶血程度對血清胰島素檢測結果的影響 未溶血組、輕度溶血組、中度溶血組、重度溶血組血清標本胰島素檢測結果分別為（28．3±37．76）、（21．23±26．56）、（17．65±22．65）、（12．26±15．34）μIU／mL，輕度溶血組、中度溶血組、重度溶血組的檢測結果均低于未溶血組，與未溶血組比較，配對t檢驗P值均小于0．05；輕度溶血組檢測結果高于中度溶血組、重度溶血組，但配對t檢驗顯示比較差異均無統計學意義（P＞0．05）；中度溶血組檢測結果高于重度溶血組，但配對t檢驗顯示比較差異無統計學意義（P＞0．05）。

2．2 溶血時間對血清胰島素檢測結果的 僅考慮溶血時間對胰島素檢測結果的影響時，0、0．5、2、18h檢測結果分別為（28．3±37．76）、（23．22±29．63）、（18．1±23．57）、（9．81±11．34）μIU／mL，其中0．5、2、18h胰島素檢測結果均低于0h檢測結果，配對t檢驗顯示比較差異均有統計學意義（P＜0．05）；0．5h胰島素檢測結果高于2h檢測結果，但二者比較差異無統計學意義（P＞0．05）；0．5h胰島素檢測結果高于18 h檢測結果，且二者比較差異有統計學意義（P＜0．05）；2h胰島素檢測結果高于18h檢測結果，且二者比較差異有統計學意義（P＜0．05）。溶血標本不同時間點胰島素檢測結果呈下降趨勢（見圖1），且溶血標本不同時間點胰島素檢測結果比較差異有統計學意義（F＝18．424，P＜0．05），溶血時間越長，胰島素水平下降越明顯。

圖1 胰島素水平隨溶血時間變化的曲線圖

2．3 溶血程度和溶血時間對胰島素檢測結果的綜合影響 當考慮溶血程度和溶血時間對血清胰島素檢測結果的綜合影響時，檢測結果數據分析見表1及圖2。在不同溶血程度組中，不同時間點胰島素結果分析顯示，輕度溶血組、中度溶血組、重度溶血組的溶血時間為0．5h時的胰島素檢測結果與溶血時間為2h的檢測結果相比，比較差異均無統計學意義，P值均大于0．05，但2h與18h檢測結果相比，比較差異均有統計學意義（P＜0．05）；0．5h與18h檢測結果相比，比較差異均有統計學意義（P＜0．05）。重復測量設計的方差分析顯示，不同溶血程度標本與溶血時間對胰島素檢測結果的影響比較差異有統計學意義（F＝3．269，P＜0．05），說明在不同溶血標本組內，胰島素檢測結果隨時間變化的趨勢不同；胰島素檢測結果在3個時間段內隨時間變化呈成線性變化（F＝19．942，P＜0．05）；不同溶血程度組間胰島素檢測結果相比，比較差異則無統計學意義（F＝1．122，P＞0．05）。

表1 溶血程度和溶血時間對血清胰島素的影響

圖2 胰島素檢測結果隨溶血程度和時間變化的趨勢

3 討 論

時間分辨免疫熒光分析法是測定胰島素水平的常用方法之一，具有檢測成本低、靈敏度高等優點。在臨床檢驗工作中，標本溶血的現象并不少見。隨著紅細胞破裂，IDE釋放進入血清中，導致溶血標本血清胰島素濃度下降。本研究結果也顯示，不同溶血程度標本胰島素檢測結果與未溶血標本檢測結果比較差異具有統計學意義（P＜0．05），但Hb濃度對胰島素檢測結果影響的差異并無統計學意義（P＞0．05），與溶血時間卻有一定的相關性（P＜0．05）。隨著溶血時間的延長，胰島素濃度也會下降。因此，對于存在溶血現象的標本，應盡量選擇重新采集標本，否則應盡快檢測，并在結果報告單中標明“標本溶血”等字樣。

出現本研究結果的原因可能有三方面因素：（1）本研究中溶血標本的制備使用的是來源于健康者的Hb。有研究證實，2型糖尿病患者紅細胞內的IDE活性顯著高于健康者，即健康者的紅細胞IDE活性較低，輕度溶血的情況下就能達到飽和狀態，且在很長的一段時間內都保持相同的降解速度，導致2h內檢測結果無明顯差異［3］。這與其他研究報道的胰島素濃度下降程度與溶血程度呈正相關，即溶血程度越高，其濃度下降越明顯有所不同［7］。（2）可能是由于標本量較少，導致部分數據間無明顯差異。本研究僅使用了30例標本，或許未能充分反映溶血程度導致的檢測結果之間的差異性。（3）時間分辨免疫熒光分析法定量檢測胰島素對實驗結果存在一定的影響。采用時間分辨免疫熒光分析法進行檢測時，手工操作步驟相對較多，所需時間較長，影響結果的因素也相應較多。因此，在臨床檢測工作中，應特別注意以下事項：專人操作以保證操作手法的一致性；將實驗溫度控制在恒定狀態（最好為25℃）；保證實驗環境、儀器的清潔；不同批號的試劑、校準品不能混用；銪標記物稀釋后應在1h內使用，加樣時保持吸頭的均勻通暢，微孔板的震蕩時間必須保證至少5min；洗液必須臨用前配制［8］。只有控制好實驗操作中的各個步驟和環節，盡可能克服上述各種因素的影響，才能獲得滿意的實驗結果，為臨床醫師的提供盡可能準確、客觀的輔助診斷數據。

本研究初步探討了溶血對時間分辨免疫熒光分析法定量檢測胰島素的影響，在以后的研究中可增加相應的糾正措施，并通過二元一次方程確定溶血程度、胰島素檢測結果和標本真實值三者的關系，并用回歸方程糾正其影響［9－10］。

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