單核苷酸位點C19007T多態性與宮頸癌易感性的相關性分析＊

吳世木，陳 俊，楊瑞賓，韋入翠，陸 紅，陳瑞連（貴州省興義市人民醫院檢驗科 562400）

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一。雖然近年來宮頸癌的病死率有所下降，但其發病率卻呈上升趨勢［1］。加強宮頸癌早期風險預測，對于降低其發病率具有重要意義［2］。宮頸癌的發生與DNA損傷修復能力異常相關。核苷酸切除修復交叉互補基因1（ERCC1）是一種重要的DNA損傷修復基因。已有研究發現，ERCC1基因單核苷酸多態性（SNP）位點突變可導致ERCC1表達水平的異常，從而影響腫瘤易感性［3］。本研究探討了ERCC1基因C19007T位點與宮頸癌易感性的關系，以及為宮頸癌早期風險預測提供新的指標，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料 2011年3月至2013年6月本院婦科收治的宮頸癌患者48例納入宮頸癌組，所有患者均經組織病理學檢查確診，年齡39～56歲，平均（43．72±9．64）歲；組織學類型包括鱗癌35例（72．92%），腺癌6例（12．50%），腺鱗癌5例（10．42%），其他2例（4．17%）；按國際婦科腫瘤組織（FIGO）2000年臨床分期標準，臨床病理分期為Ⅰ期30例（62．50%），Ⅱ期15例（31．25%），Ⅲ期2例（4．17%），Ⅳ期1例（2．08%）。同期于本院接受健康體檢，且未檢出宮頸病變的健康女性48例納入對照組，年齡38～55歲，平均（44．29±8．95）歲。所有入選對象均為漢族。受試對象年齡分布比較差異無統計學意義（P＞0．05），具有可比性。

1．2 方法

1．2．1 提取基因組DNA 采用一次性真空乙二胺四乙酸二鉀抗凝采血管采集所有受試對象晨起空腹靜脈血3～5mL，采用TIANamp試劑盒提取血液基因組DNA，于－80℃保存。

1．2．2 基因分型 通過Ensembl數據庫查找C19007T位點序列，利用Primer Premier 5．0軟件設計聚合酶鏈反應（PCR）擴增引物，上游引物序列為3′－ACT TGT GAA GGA CGG GAG T－5′，下 游 引 物 序 列 為 3′－GTC ACA AGA CCT GAC AAG ATA CTC－5′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用PCR－限制性片段長度多態性（PCR－RFLP）基因分型方法對C19007T位點多態性進行分型，擴增目標片段長度為545bp。PCR擴增體系為25μL，包括20ng DNA模板、0．25μmol／L引物、1UTag DNA 聚合酶、0．4mmol／L dNTP和2mmol／L MgCl2。PCR擴增條件為94℃2min，94℃30 s、55℃30s、72℃40s循環35次，72℃6min。取4μL PCR擴增產物，在1%瓊脂糖凝膠中電泳，采用紫外分析儀檢測PCR產物電泳結果。利用1UBsr DⅠ限制性內切酶對PCR擴增產物進行酶切，37℃水浴過夜后，采用1．5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果。

1．3 統計學處理 采用SPSS17．0軟件進行數據處理和統計學分析。采用擬和優度卡方檢驗分析C19007T位點在宮頸癌組和對照組中的基因型頻率分布是否符合Hardy－Weinberg平衡法則，采用卡方檢驗比較兩組基因和基因型頻率的差異，采用Logistic回歸模型分析C19007T位點基因和基因型頻率與宮頸癌易感性的相關性；所有統計檢驗均為雙側檢驗，P＜0．05為比較差異具有統計學意義。

2 結 果

2．1 C19007T位點酶切多態性和基因分型結果 對照組和宮頸癌組檢測結果均顯示C19007T位點存在多態性。C19007T位點擴增片段大小為545bp，Bsr DⅠ酶切后可產生3種基因型，分別是CC、CT和TT。CC基因型為1條片段，大小為545 bp；TT基因型為2條片段，大小分別為158、387bp；CT基因型為3條片段，大小分別為545、387、158bp。見圖1。

2．2 C19007T位點等位基因和基因型頻率分布 宮頸癌組CC、CT和 TT基因型頻率分別為52．08%、33．33%、14．58%，對照組分別為64．58%、31．25%、4．17%，基因型頻率組間比較差異具有統計學意義（χ2＝4．53，P＜0．05）。宮頸癌組 C、T基因頻率分別為68．75%%、31．25%，對照組分別為80．21%、19．79%，基因頻率分布組間比較差異有統計學意義（χ2＝5．87，P＜0．05）。C19007T位點等位基因和基因型頻率分布，見表1。對C19007T位點的基因型分布進行Hardy－Weinberg平衡檢測，卡方值分別為0．637和0．654，P值分別為0．137和0．254，均符合Hardy－Weinberg平衡法則，且吻合度良好（P＞0．05），說明研究樣本具有群體代表性。

圖1 C19007T位點PCR擴增產物酶切片段電泳結果

表1 C19007T位點等位基因和基因型頻率分布［n（%）］

2．3 C19007T位點多態性與宮頸癌易感性的相關性分析在加性、顯性和隱性三種遺傳模型下，對總體樣本ERCC1基因C19007T位點多態性與宮頸癌患病風險進行Logistic回歸分析，結果見表2。在加性遺傳模型下，C19007T位點多態性預測宮頸癌的比值比（OR）達到3．78（P＜0．05），對性別、年齡、體質量指數（BMI）進行校正后，C19007T位點多態性預測宮頸癌的OR為3．54（P＜0．05）。在顯性和隱性模型下，OR差異無統計學意義（P＞0．05）。

表2 不同遺傳模型中C19007T位點多態性與宮頸癌易感性相關性分析

3 討 論

已有研究證實，宮頸癌的發生與人乳頭瘤病毒（HPV）感染密切相關［4］。然而，僅有小部分的HPV感染者發生宮頸癌。因此，個體的遺傳特征有可能是影響宮頸癌易感性的決定性因素［5］。SNP是最為常見的一種遺傳變異，也是導致個體間差異的遺傳物質基礎，例如對宮頸癌等惡性腫瘤的易感性差異。研究表明，DNA損傷修復基因對于保證基因組的穩定性和避免DNA復制過程中發生堿基錯配起著重要作用［6］。DNA修復能力低下或缺陷可導致無法對受損DNA進行有效和及時修復，進而引起基因突變和細胞癌變，增加個體罹患腫瘤的危險性。個體間DNA修復能力的差異主要取決于DNA修復基因的多態性，因而DNA修復基因的多態性可能是決定腫瘤易感性的重要因素［7］。ERCC1基因是一種重要的DNA損傷修復基因，已有研究發現ERCC1基因SNP位點突變可改變ERCC1蛋白的表達水平，進而影響腫瘤易感性［8］。

本研究探討了宮頸癌患者和健康者ERCC1基因C19007T位點的多態性，結果發現C19007T位點擴增片段酶切后可產生CC、CT和TT三種基因型，且宮頸癌患者和健康者CC、CT和TT基因型和基因頻率比較差異有統計學意義（P＜0．05），表明宮頸癌患者和健康者ERCC1基因C19007T位點確實存在多態性；進一步對C19007T位點的多態性與宮頸癌易感性的進行相關性分析，結果發現C19007T位點多態性預測宮頸癌的OR達到3．78（P＜0．05），表明C19007T位點多態性與宮頸癌的發生存在密切關系，其中C19007T位基因型TT和等位基因T有可能增加宮頸癌的易感性，因此，該位點可作為預測宮頸癌發病風險的指標，這與熊興東等［9］的研究結果一致。

C19007T位點突變可導致密碼子AAC變為AAT，盡管沒有改變所編碼的氨基酸（天冬酰胺），但是T等位基因的存在可能會影響mRNA的穩定性，導致ERCC1 19007T的mRNA水平下降50%［10］。在卵巢癌細胞系中，T等位基因與ERCC1mRNA低表達相關，提示T等位基因也可能降低DNA修復能力［11］。有研究報道，ERCC1G19007A位點的TT基因型或含T等位基因的單倍型均可顯著增加食管癌、乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤的發病風險［12］。

綜合上述，筆者認為宮頸癌的發生與ERCC1基因C19007T位點多態性存在一定的相關性，C19007T位點基因型TT和等位基因T可增加宮頸癌的易感性，該位點可作為宮頸癌風險預測的指標。

［1］ 李琦，胡昌華，張婧．宮頸脫落細胞RASSF1A基因甲基化在宮頸癌中的臨床意義［J］．檢驗醫學與臨床，2013，10（12）：1518－1519．

［2］ 焦夕琴．宮頸癌患者白細胞抗原－DRB1與－DQB1與人乳頭瘤病毒16感染的關系［J］．檢驗醫學與臨床，2012，9（8）：957－958．

［3］Ivansso EL，Juko－Pecirep I，Gyllensten UB．Interaction of immunological genes on chromosome 2q33and IFNG in susceptibility to cervical cancer［J］．Gynecol Oncol，2010，116（3）：544－548．

［4］ Tibaldi C，Giovannetti E，Vasile E，et al．Correlation of CDA，ERCC1and XPD polymorphisms with response and survival in gemcitabine／cisplatin－treated advanced nonsmall cell lung cancer patients［J］．Clin Cancer Res，2008，14（6）：1797－1803．

［5］ 王寧，張揚，張淑蘭．TNF－α基因rs1800629位點多態性與漢族人群子宮頸癌發生風險無關［J］．中國醫科大學學報，2012，41（8）：730－733．

［6］ 洪小山，曾俐琴，羅喜平．hEXO1A238G基因多態性與宮頸癌的易感相關性研究［J］．廣東醫學，2012，33（2）：188－191．

［7］ Al－Minawi AZ，Lee YF，Hakansson D，et al．The ERRC1／XPF endonuclease is required for completion of homologous recombination at DNA replication forks stalled by inter strand cross links［J］．Nucleic Acids Res，2011，37（19）：6400－6413．

［8］ Fernandes MS，Carneiro F，Oliveira C，et al．Colorectal cancer and RASSF family－A special emphasis on RASSF1A［J］．Int J Cancer，2013，132（2）：251－258．

［9］ 熊興東，古李中，曾俐琴，等．DNA修復基因ERCC1 C19007T多態與宮頸癌發生的相關性研究［J］．實用婦產科雜志，2010，26（4）：286－289．

［10］Nexo BA，Vogel U，Olsen A，et al．A specific haplotype of single nucleotide polymorphisms on chromosome 19q13．2－3encompassing the gene RAI is indicicative of postmenopausal breast cancer before age 55［J］．Carcinogenesis，2011，24（5）：899－904．

［11］李華，郭紅燕，孫瞳．Fas和Fas配體基因啟動子單核苷酸多態性與子宮頸癌的發病風險［J］．中華腫瘤雜志，2009，31（1）：38－41．

［12］Deligeoroglou E，Christopoulos P，Aravantinos L，et al．Human papilloma Virus molecular profile and mechanisms of cancerogenesis：a review［J］．Eur J Gynsecol Oncol，2012，30（2）：128－132．