瑞舒伐他汀抑制小鼠哮喘模型慢性氣道炎癥反應(yīng)的實驗研究＊

張 維，朱 濤，王導(dǎo)新，鄧 潔，李萬成

（1.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，四川 成都 610000；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 成都 610041；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 400010）

支氣管哮喘（bronchial asthma）簡稱哮喘，目前被定義為由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的慢性氣道炎癥性疾?。?～3］。慢性持續(xù)的氣道炎癥是哮喘的根本原因［1～3］。雖然GINA指南的廣泛推廣和接受，以及吸入激素（ICS）和長效β2激動劑（LABA）的使用使哮喘的臨床控制有所提高，但是哮喘的死亡率和急診住院率并未有明顯改善［1～3］。新的治療藥物的研究仍然是哮喘研究熱點。目前發(fā)現(xiàn)他汀類藥物具有廣泛的抗炎作用和免疫調(diào)節(jié)作用［4～6］。本研究旨在探討瑞舒伐他汀在慢性哮喘模型中的抗炎作用和治療價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性BALB／C小鼠30只，6～8周齡，體重18～22g（四川大學(xué)實驗動物中心提供）；卵清蛋白（ovalbumin，OVA）購于美國Sigma公司；瑞舒伐他汀購于瑞典阿斯利康公司；TNF－α、IL－4、IL－5和IL－13ELISA試劑盒均購于美國R＆D公司。

1.2 動物模型建立 在實驗的第1、7、14天通過腹腔注射10μgOVA和100μgAL（OH）3配制成的溶液致敏。從第15～81天將小鼠置于特制塑料容器內(nèi)，用超聲霧化器噴入5%OVA生理鹽水10ml激發(fā)1小時。OVA激發(fā)后小鼠出現(xiàn)煩躁、嗆咳、呼吸加快及輕度紫紺等哮喘發(fā)作癥狀［2］。實驗動物分為3組，即空白對照組（Control group）、卵清蛋白＋瑞舒伐他?。∣VA＋RUS group）和卵清蛋白組（OVA group），每組10只，分籠飼養(yǎng)。①Control組：注射等量0.9%生理鹽水代替OVA，并吸入0.9%生理鹽水10ml，余同OVA組。②OVA組：按上述方法制備哮喘模型。③OVA＋RUS組：每次激發(fā)前30min皮下注射瑞舒伐他汀（30mg／kg·d），15～81天。在實驗的81天腹腔注射戊巴比妥（50mg／Kg）麻醉小鼠，下腔靜脈放血處死，并將生理鹽水注入右心室沖洗兩次以洗盡肺內(nèi)殘留血液。

1.3 支氣管肺泡灌洗液（BALF）細(xì)胞計數(shù) 末次霧化吸入24小時后，以1%戊巴比妥鈉（50mg／kg）腹腔注射麻醉后，以靜脈留置導(dǎo)管作氣管插管遙以1、0.8 ml磷酸鹽緩沖液（PBS）分2次作支氣管肺泡灌洗，并收集BALF 1ml。BALF在4°C下以400r／min離心5min，沉渣以100μl PBS液重懸。使用Diff－Quik染色后做細(xì)胞分類計數(shù)。下腔靜脈放血處死小鼠，打開胸腔，結(jié)扎右總支氣管于遠(yuǎn)端切下放于10%中性甲醛中保存。

1.4 支氣管肺泡灌洗液（BALF）細(xì)胞因子水平分析根據(jù)購買公司試劑盒方法對BLAF中TNF－α、IL－4、IL－5和IL－13水平進(jìn)行分析。

1.5 HE染色和PAS染色 取右下肺組織，常規(guī)制成5μm的石蠟切片，HE染色觀察小鼠肺組織病理改變。PAS染色法檢測肺組織粘蛋白糖原表達(dá)情況，粘蛋白糖原呈PAS陽性染色，氣道PAS陽性細(xì)胞主要為杯狀細(xì)胞和粘液腺細(xì)胞，其定量分析可代表氣道粘液表達(dá)水平。肺組織PAS染色后，對每只小鼠隨機(jī)取至少10個直徑在100～200μm支氣管進(jìn)行PAS陽性細(xì)胞和PAS陰性細(xì)胞計數(shù)，并用PAS陽性細(xì)胞／支氣管總細(xì)胞的百分比來表示。切片采用Image－Pro Plus（Media Cybernetics，Silver Spring，Md）圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析［2］。

2 結(jié)果

2.1 BALF中細(xì)胞計數(shù)水平 OVA致敏和激發(fā)后小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)明顯增加（均P＜0.05），同時與OVA＋RUS組相比較，OVA組增加更加顯著（均P＜0.05），見表1。

2.2 BALF中細(xì)胞因子水平 OVA致敏和激發(fā)后小鼠BALF中 TNF－α、IL－4、IL－5 和 IL－13水平明顯增加（均P＜0.05），同時與 OVA＋RUS組相比較，OVA組增加更加顯著（均P＜0.05），見表2。

2.3 小鼠肺組織病理學(xué)變化與氣道粘液分泌 肺組織切片常規(guī)HE染色和PAS染色，光鏡下觀察?？瞻捉M小鼠肺組織中小氣道及血管周圍未見炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管柱狀上皮細(xì)胞無增生，無杯狀細(xì)胞增生，基底膜下未見平滑肌增殖，管腔未見狹窄；OVA組小鼠肺組織中小氣道及血管周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管上皮細(xì)胞增生明顯，杯狀細(xì)胞明顯增多，粘液分泌增多，基底膜增厚明顯，并見顯著平滑肌增殖；OVA＋RUS組小鼠肺組織中小氣道及血管周圍可見炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管上皮細(xì)胞增生，杯狀細(xì)胞增加，粘液分泌增多，基底膜增厚和平滑肌增殖，但無OVA組顯著。同時PAS染色發(fā)現(xiàn)，OVA致敏和激發(fā)后小鼠支氣管PAS陽性細(xì)胞數(shù)較空白組明顯增加，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且與OVA＋RUS組比較，OVA組增加更明顯，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1、2，表3。

表1 各組BALF中細(xì)胞水平計算（×104／ml，n＝10，）Table 1 The cells in BALF

表1 各組BALF中細(xì)胞水平計算（×104／ml，n＝10，）Table 1 The cells in BALF

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與OVA組比較，P＜0.05

3.2±1.6 0±0 0±0 0.9±0.2 1.5±0.4 OVA＋RUS組 12.4±2.5①② 2.1±0.4①② 1.5±0.4①② 2.2±0.8①② 2.6±0.9①②OVA組 23.4±4.8① 4.2±0.8① 3.1±0.6① 4.1±0.9① 5.1±1.1組別 細(xì)胞總數(shù) 嗜酸性粒細(xì)胞 中性粒細(xì)胞 淋巴細(xì)胞 巨噬細(xì)胞對照組①

表2 各組BALF中細(xì)胞因子水平（n＝10，）Table 2 The cytokines in BALF

表2 各組BALF中細(xì)胞因子水平（n＝10，）Table 2 The cytokines in BALF

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與OVA組比較，P＜0.05

組別 IL－4（×102 pg／ml） IL－5（×102 pg／ml） IL－13（×103 pg／ml） TNF－α（×103 pg／ml）1.27±0.25 4.55±0.12 0.82±0.16 1.03±0.13 OVA＋RUS組 1.64±0.37①② 8.24±1.36①② 1.46±0.31①② 1.36±0.24①②OVA組 2.69±0.86① 14.33±2.54① 3.21±0.48① 3.67±0.74對照組①

圖1 各組小鼠肺組織病理改變（HE染色×400）Figure 1 The pathological changes of lung（HE Staining×400）

圖2 各組小鼠肺組織糖蛋白表達(dá)情況 （PAS染色×400）Figure 2 The glycoprotein in the mice

表3 各組小鼠氣道糖原表達(dá)PAS染色百分?jǐn)?shù)（n＝10，）Table 3 The percent of clycogen and PAS

表3 各組小鼠氣道糖原表達(dá)PAS染色百分?jǐn)?shù)（n＝10，）Table 3 The percent of clycogen and PAS

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與OVA組比較，P＜0.05

組別 PAS染色百分?jǐn)?shù) （×10－2）3.6±2.6 OVA＋RUS組 37.8±7.9①②OVA組 58.4±10.2對照組①

3 討論

支氣管哮喘（bronchial asthma）簡稱哮喘，目前定義為一種由多種細(xì)胞（包括嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等）和細(xì)胞組分（包括多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)）參與的慢性氣道炎癥性疾?。?～3］。雖然近些年隨著GINA指南知識的普及，吸入激素（ICS）和長效β2激動劑（LABA）的聯(lián)合應(yīng)用的推廣使哮喘的臨床控制水平有了較大幅度提高，但是慢性哮喘患者的受益卻仍然有限［1～3，7］。目前認(rèn)為慢性哮喘可以引起氣道重構(gòu)（airway remodeling），并導(dǎo)致氣道不完全可逆性狹窄［1～3］。氣道重構(gòu)的主要表現(xiàn)包括氣道上皮細(xì)胞增殖，杯狀上皮細(xì)胞化生，粘液分泌增加，氣道上皮基底膜增厚，基底膜下膠原沉積，氣道平滑肌細(xì)胞（ASM）增生肥大及肺小血管的增殖性改變等［2，8～10］。

他汀類藥物主要通過抑制羥甲基戊二酰輔酶A（HMG－CoA）還原酶改善機(jī)體的脂肪代謝。但目前的研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物還具有除改善脂代謝以外，還具有抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、凋亡以及抗腫瘤等多種作用，同時發(fā)現(xiàn)這些作用與抑制羥甲基戊二酰輔酶A （HMG－CoA）還原酶無明顯的聯(lián)系［4～6，11］。目前研究證實，他汀類藥物的抗炎作用與抑制核轉(zhuǎn)錄因子－κB（NF－κB）密切相關(guān)［6］。瑞舒伐他汀是他汀類藥物中作用較強(qiáng)的制劑。

我們的實驗中，HE染色提示肺組織出現(xiàn)明顯的病理改變，包括小氣道及血管周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管上皮細(xì)胞增生明顯，杯狀細(xì)胞明顯增加，粘液分泌增多，基底膜增厚明顯和顯著的平滑肌增殖。但與OVA組相比較，OVA＋RUS組病理改變較輕，表明瑞舒伐他汀能夠有效抑制OVA誘導(dǎo)的小鼠肺組織的炎癥反應(yīng)。同時研究認(rèn)為，哮喘相關(guān)的炎癥狀態(tài)可導(dǎo)致氣道柱狀上皮細(xì)胞向杯狀上皮細(xì)胞化生，導(dǎo)致氣道粘液分泌明顯增加［1～3］。氣道粘液過度分泌可以導(dǎo)致氣道不可逆性阻塞，是致死性哮喘和難治性哮喘的重要原因［1～3］。

4 結(jié)論

瑞舒伐他汀可以有效抑制OVA誘導(dǎo)的慢性哮喘導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)和氣道粘液分泌，緩解氣道狹窄。但具體的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步探討。

［1］von Mutius E，Hartert T.Update in asthma 2012［J］.Am J Respir Crit Care Med，2013，188（2）：150－156.

［2］朱 濤，任旭斌，朱 靜，等.γ－氨基丁酸 A型受體調(diào)節(jié)哮喘動物模型氣道重構(gòu)的實驗研究［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，30（4）：842－846.

［3］李祖敏，黃錚錚.甘草酸二銨輔助治療咳嗽變異性哮喘發(fā)作期的臨床研究［J］.西部醫(yī)學(xué)，2012，24（11）：2081－2083.

［4］Spite M，Serhan CN.Novel lipid mediators promote resolution of acute inflammation：impact of aspirin and statins［J］.Circ Res，2010，107（10）：1170－1184.

［5］Zeki AA，Kenyon NJ，Goldkorn T.Statin drugs，metabolic pathways，and asthma：a therapeutic opportunity needing further research［J］.Drug Metab Lett，2011，5（1）：40－44.

［6］Ni XQ，Zhu JH，Yao NH，et al.Statins suppress glucose－induced plasminogen activator inhibitor－1expression by regulating RhoA and nuclear factor－κB activities in cardiac microvascular endothelial cells［J］.Exp Biol Med（Maywood），2013，238（1）：37－46.

［7］李 蘊，梁宗安，李素云，等.復(fù)方黃龍湯對哮喘小鼠氣道炎癥的影響與機(jī)制［J］.西部醫(yī)學(xué)，2012，24（11）：2051－2056.

［8］YunYan X，Shuhe W，Mingyao L，et al.A GABAergic system in airway epithelium is essential for mucus overproduction in asthma［J］.Nat Med，2007，13（7）：862－867.

［9］Malik S，Sharma AK，Bharti S，et al.In vivo cardioprotection by pitavastatin from ischemic－reperfusion injury through suppression of IKK／NF－κB and upregulation of pAkt－e－NOS［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2011，58（2）：199－206.

［10］Alexeeff SE，Litonjua AA，Sparrow D，et al.Statin use reduces decline in lung function：VA Normative Aging Study［J］.Am J Respir Crit Care Med，2007，176：742－747.

［11］Schonbeck U，Libby P.Inflammation，immunity，and HMGCoA reductase inhibitors：statins as antiinflammatory agents［J］.Circulation，2004，109：II18－II26.