反義cyclinD1基因轉染后人角膜基質細胞增生改變的實驗研究

黃海東，康景佳，尹 祿，管 迪，張 欣，李泓甫

（武警遼寧省總隊醫(yī)院眼科，遼寧 沈陽 110034）

角膜基質細胞（corneal stromal fibroblasts）作為角膜基質的重要細胞成分之一，是角膜維持透明性的關鍵因素，在角膜基質代謝中起重要作用。角膜發(fā)生潰瘍時，角膜基質細胞活化，變形，進而纖維化，成為角膜成纖維細胞的主要來源，參與組成角膜防御系統(tǒng)［1，2］。cyclinD1是細胞增生內源性調控系統(tǒng)的主要組成部分，在G1期啟動，調控G1～S期過程，是細胞增生調控的主要增生信號［3，4］。本研究觀察反義cyclinD1基因轉染對人角膜基質細胞增生的影響效果，旨在為眼科疾病的基因治療提供依據。

1 實驗與方法

1.1 實驗所用的人角膜組織均在沈陽軍區(qū)總醫(yī)院眼庫獲得。將人角膜組織裁剪成塊后進行原代細胞培養(yǎng)以獲得人角膜基質細胞。通過胰蛋白酶消化法按照1∶2傳代獲得處于生長期的第2代人角膜基質細胞用于實驗。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 美國Gibco公司生產的陽離子脂質體lipofectamine；北京大學第一醫(yī)院中心實驗室存有的反義cyclinD1基因；美國Maxim公司研發(fā)的鼠抗人／兔cyclinD1單克隆抗體工作液以及兔抗鼠SP免疫組織化學試劑盒；美國Sigma公司生產的MTT（四甲基偶氮唑鹽）；北京昌化精細化工廠制造的DMSO（二甲基亞砜）；美國NAPCO公司生產的CO2恒溫培養(yǎng)箱；日本Olympus公司制造的生物顯微鏡；香港悅泰洋行銷售的酶聯(lián)免疫檢測儀。

1.2.2 實驗方法 細胞計板制備角膜基質單細胞懸液共2×105／mL，取2ml在3個內置蓋玻片的6孔板內進行接種，3個板分別對應3組。以無血清DMEM液對1μl的反義cyclinD1質粒或1μl的 PBS至100μl，稀釋 4μl的 Lipofectamine 或 4μl的 PBS 至100μl，輕混稀釋液，室溫下進行孵育（30min），加入無血清培養(yǎng)液0.8ml，緩慢加入轉染準備細胞中（細胞80%融合，無血清DMEM沖洗），放置在CO2恒溫培養(yǎng)箱（37度）24小時，除掉轉染液，加入DMEM培養(yǎng)液（含20% 的FBS）進行培養(yǎng)，每日換培養(yǎng)液。實驗重復3次。終止轉染后第2、6、10d，在3個板中取細胞爬片，冷丙酮固定后PBS沖洗，加入鼠抗人／兔cyclinD1單克隆抗體（比例為1∶100），4℃下放置1夜，加入經過生物素標記處理的兔抗鼠二抗（1∶200），返藍，脫水，透明，封片及攝片處理后，生物顯微鏡下進行觀察cyclinD1蛋白表達。

1.3 評價指標 免疫細胞化學法記錄轉染后cyclinD1蛋白表達情況。0.5%錐蟲藍染色法分析細胞活性。生物顯微鏡下細胞核顯示為棕褐色著染陽性。用Combridge Quantimete 970型圖像分析儀以及Quips軟件編制測量cyclinD1陽性信號程序。生物顯微鏡攝取細胞圖像，中央處理器進行細胞樣本掃描、轉換及測量細胞陽性信號吸光度值（A值）。MTT法檢測測定570nm下每孔吸光度值（A570值）。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 15.0統(tǒng)計學軟件處理，計數資料用表示，各組樣本均數采用方差齊性檢驗，不同時點的A值及A570值用單因素方差分析，組間比較采用LSD－t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學法檢測轉染后cyclinD1蛋白表達情況 對照1組和對照2組提示多數細胞核cyclinD1染色呈陽性，實驗組僅有少量細胞核cyclinD1染色呈陽性，見圖1、2。轉染后，對照1組與對照2組A值略有下降，但兩組間無顯著差異（P＞0.05）。實驗組A值下降明顯，與對照1、2組比較，差異有顯著性，見表1。

圖1 對照1組轉染后，大量細胞核cyclinD1量細胞核cyclinD1染色呈陽性Figure 1 Large amount of positive dyeing of cyclinD1in nucleus in control group 1

圖2 反義cyclinD1轉染組轉染后，少 染色呈陽性Figure 2 Few positive dyeing of cyclinD1in nucleus after antisense cyclinD1transfection

表1 不同時間點各組轉染后cyclinD1表達情況（）Table 1 The comparison on cyclinD1expression after gene transfection for different time

表1 不同時間點各組轉染后cyclinD1表達情況（）Table 1 The comparison on cyclinD1expression after gene transfection for different time

組別2d 6d 10d對照1組658.29±29.37645.97±36.18662.87±31.65對照2組 678.34±42.41650.83±60.42625.76±54.64實驗組 426.32±56.39438.36±63.25454.27±71.18 F 15.397 12.937 9.254 P 0.023 0.021 0.037

2.2 反義cyclinD1轉染后人角膜基質細胞增生的改變 反義cyclinD1轉染后，A570值顯著低于未進行反義cyclinD1轉染的對照1組和對照2組，差異有顯著性（P＜0.05），提示反義cyclinD1具有抑制人角膜基質細胞增生的作用。對照1組與對照2組間A570值無顯著性差異（P＞0.05），提示lipofectamine對人角膜基質細胞增生無顯著作用，見表2。

表2 不同時間點各組轉染后A570值比較（）Table 2 The comparison on A570values after gene transfection for different time

表2 不同時間點各組轉染后A570值比較（）Table 2 The comparison on A570values after gene transfection for different time

組別2d 6d 10d對照1組0.583±0.0360.451±0.0390.429±0.031對照2組 0.549±0.0510.421±0.0870.403±0.028實驗組 0.392±0.0470.294±0.0340.291±0.031 F 16.387 13.856 10.349 P 0.021 0.027 0.038

3 討論

本實驗通過體外培養(yǎng)原代細胞獲取人角膜基質細胞，通過免疫組織化學法以及MTT法檢測，生物顯微鏡攝取cyclinD1著染圖像，計算機圖像處理系統(tǒng)分析，觀察反義cyclinD1轉染后，人角膜基質細胞增生情況的變化。結果顯示，轉染后2、6、10d，反義cyclinD1轉染組A值以及A570值降低明顯，與其他兩組比較，差異有顯著性（P＜0.05）。但觀察時間延長，相關數值有所回升，提示陽離子脂質體能夠介導人角膜基質細胞進行反義cyclinD1轉染，外源基因表達具有時間限制，不能與宿主細胞基因組進行整合，能夠滿足手術或創(chuàng)傷后進行抑制基質細胞增生的需求。MTT法檢測提示陽反義cyclinD1基因轉染能夠對人角膜基質細胞增生進行抑制，而陽離子脂質體對細胞增生不具有影響作用。Motkura等在1991年首次在甲狀旁腺腺瘤中克隆和鑒定出cyclinD1基因［5］。cyclinD1基因位于11q13染色體上，基因編碼區(qū)含有高含量GC，末端含有1個Poly－A區(qū)（由69個腺苷酸殘基組成），全長120kb，有5個外顯子和4個內含子組成，編碼蛋白共有295個氨基酸殘基，第56～141位氨基酸序列稱Cyclinbox，為保守序列［6］。cyclin D1是G1期細胞的細胞周期素，能夠調控G1／S轉換，目前相關研究已經證實cyclinD1協(xié)同Rb基因，控制CyclinD1－CDK4復合物形成，共同對G1期進程進行調控［7］。CyclinD1是已知的重要細胞周期調節(jié)因子，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切關聯(lián)［8～10］，而隨著研究的不斷深入以及基因治療在眼科治療的新思路，反義基因轉染技術進行抑制細胞增生的研究逐漸成為臨床研究的熱點［11，12］。本實驗研究證實了反義cyclinD1基因轉染能夠抑制細胞增生，但是關于人角膜基質細胞反義cyclinD1基因轉染后，RNA水平上的cyclinD1變化仍需進一步探討和揭示。

4 結論

反義cyclinD1基因轉染，一定時間內降低cyclinD1表達，抑制人角膜基質細胞增生，是角膜過度愈合反應的基因治療的基礎。

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