機械拉伸對兔角膜成纖維細胞增殖和遷移的影響

劉成星，李曉娜，馮鵬飛，安美文，陳維毅

（太原理工大學 應用力學與生物醫學工程研究所，太原 030024）

角膜是影響視覺的重要組織。由于眼壓的波動，人角膜在生理性情況下即發生周期性變形[1]。眼屈光手術使角膜受到了一定程度的機械損傷，也改變了角膜所處的力學環境[2]。角膜基質細胞受損后首先發生凋亡，隨后角膜基質細胞發生增殖和遷移，并轉化成角膜成纖維細胞和肌成纖維細胞，對受損角膜進行損傷修復[3]。研究表明，一些細胞因子如EGF和bFGF在角膜細胞的增殖和遷移過程中發揮了重要作用[4-5]；機械牽拉能夠影響細胞的增殖[6-7]和遷移[8-9]。而有關力學刺激對角膜細胞的增殖遷移影響尚未見報道。本文通過對兔角膜成纖維細胞進行周期性機械拉伸，探討力學刺激在角膜成纖維細胞增殖及遷移中的作用。

1 材料和方法

1.1 兔角膜成纖維細胞的原代提取、培養

本研究采用酶消化法獲取原代兔角膜成纖維細胞[10]。首先機械剝離上皮層和內皮層，然后用2 mg／mL的Ⅱ型膠原酶消化組織塊，直至培養液完全清亮，離心后獲得角膜成纖維細胞，加入胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）體積分數為10%的F12培養基，置于37℃、二氧化碳體積分數為5%的孵箱內培養。實驗使用2～5代細胞。

1.2 周期性力學加載

采用Flexcell4000柔性基底拉伸系統（美國Flexcell）對細胞實施周期性機械拉伸。將角膜成纖維細胞用質量分數0.25%胰蛋白酶消化，以3×105的密度接種于裱襯有I型膠原蛋白的BioFlex＠六孔培養板（美國Flexcell）上，置于孵箱內培養。待細胞80%融合時，進行5%拉伸應變、0.1Hz正弦波的力學加載，卸載后進行細胞周期檢測和劃痕實驗。

1.3 細胞周期檢測

用胎牛血清體積分數為10%的培養基培養細胞。卸載后12，24，36h收集細胞。細胞經4℃預冷、體積分數為70%的乙醇固定，采用細胞周期檢測試劑盒（南京凱基）通過流式細胞儀（德國Beckman）對細胞周期進行檢測，用S期（Synthesis phase，DNA合成期）占整個細胞周期的百分比表示細胞增殖情況。S期所占百分比越高，說明細胞增殖越旺盛。實驗重復3次，取均值。

1.4 劃痕實驗

如圖1所示，接種細胞前，在培養皿底壁外側用標記筆劃十字線。在Flexcell4000加載時，12.7 mm半徑之內（圖1白色區域）細胞主要受等雙軸拉伸；半徑12.7～17.8mm范圍內（圖1淺灰色環形區域），細胞主要受單軸拉伸[11]。加載前用10μL槍頭在等雙軸拉伸區域沿與標記線垂直方向劃痕，在單軸拉伸區域沿標記線平行方向劃痕。所有劃痕均與力的方向垂直。圖1中短直線代表劃痕，箭頭代表牽張力的方向。

先用FBS體積分數為2%的培養基饑餓細胞12h，使細胞周期同步化。劃痕后，用PBS清洗，去除死細胞，換成FBS體積分數1%的F12培養基。然后添加1ng／mL重構人表皮生長因子（rhEGF）或100ng／mL重構人堿性成纖維細胞生長因子（rhbFGF）（美國PeproTech），以FBS體積分數1%組作為對照。分別于0，5，10，20h拍照，測量各時刻的劃痕面積，用不同時間點的劃痕面積除以初始（0h）劃痕面積，獲得與初始面積的百分比。由于所取劃痕長度相同，因此該比值即相對劃痕寬度。相對劃痕寬度越小，說明細胞遷移速度越快。每個區域做8個劃痕，取均值。

圖1 體外劃痕實驗示意圖

1.5 數據分析

實驗結果以x±S表示。采用SPSS13.0統計分析軟件中單因素方差分析方法對數據進行統計學處理，p＜0.05為具有統計學差異。

2 實驗結果

2.1 周期性機械拉伸對角膜成纖維細胞增殖的影響

流式細胞儀檢測結果顯示，兔角膜成纖維細胞在12h相對分裂最旺盛，S期占整個細胞周期的41.17%；隨著培養時間的增加，S期占細胞周期的比例明顯降低，36h下降為19.99%（圖2-a）。與各自靜態對照組相比，5%拉伸使S期細胞比例均有所增高。拉伸12h，S期雖為靜態對照組的1.12倍，但無統計學差異（p＞0.05）；拉伸24h和36h時，S期分別為靜態對照組的1.22和1.24倍，具有顯著差異（p＜0.05）（圖2-b）。

圖2 體外周期性機械拉伸對角膜成纖維細胞增殖的影響

2.2 周期性機械拉伸對角膜成纖維細胞遷移的影響

首先我們研究了bFGF與EGF對細胞遷移的影響。劃痕實驗結果表明：無論是拉伸組還是靜態對照組，相對劃痕寬度均隨時間增加而減?。▓D3至圖5），說明細胞在損傷后均表現出不同程度的遷移行為。在未拉伸培養條件下，5h時，與1%FBS對照組相比，施加bFGF或EGF對相對劃痕寬度無明顯影響（p＞0.05）；10h后bFGF或EGF對細胞遷移行為的影響逐漸顯現，表現為其相對劃痕寬度明顯小于1%FBS對照組（p＜0.05）；拉伸條件下具有同樣趨勢（圖4）。說明bFGF和EFG對細胞遷移均具有促進作用，EFG作用效果略優于bFGF，但二者之間無顯著差別（p＞0.05）。

其次，我們研究了拉伸對角膜成纖維細胞遷移的影響。結果表明：實施5%的周期性拉伸5h，與各自靜態對照組相比，無論是等雙軸還是單軸拉伸，相對劃痕寬度均無明顯差異（p＞0.05）；10h時，等雙軸拉伸組相對劃痕寬度雖較各自靜態對照組有所增加，但二者無統計學差異（p＞0.05），而單軸拉伸組細胞遷移則明顯受到抑制，表現為相對劃痕寬度顯著大于靜態對照組（p＜0.05）；20h時，無論是等雙軸拉伸還是單軸拉伸，拉伸組相對劃痕寬度均明顯大于各自靜態對照組（p＜0.05）。說明拉伸抑制了角膜成纖維細胞的遷移，且抑制效應具有時間依賴性，拉伸時間越長，抑制效應越明顯。單軸拉伸對細胞遷移的抑制效應早于且強于等雙軸拉伸。

3 討論

角膜受損后，角膜基質由于水腫而發生膨脹，在傷口邊緣的基質細胞首先發生凋亡?；|細胞在生長因子和細胞因子的作用下向傷口處遷移、增殖，并合成各種細胞外基質，對角膜進行損傷修復。因此角膜成纖維細胞的增殖和遷移對角膜基質損傷修復具有重要意義。

如前所述，角膜本身在眼壓的周期性波動下就受到周期性牽拉的作用，屈光手術由于對基質進行了切削則使角膜受到的拉應力增大。但有關機械拉伸對角膜基質細胞的增殖和遷移的影響目前尚未見報道。我們通過對兔角膜成纖維細胞進行周期性機械拉伸后發現，低幅度的機械拉伸能夠促進兔角膜成纖維細胞增殖，但抑制了細胞遷移行為；bFGF和EGF能夠促進細胞遷移行為，因此一定程度上減弱了由牽拉引起的細胞遷移抑制效應；拉伸方式對遷移行為有影響。

據有關文獻報道，機械應力能夠影響細胞增殖[6-7]。本研究結果提示機械牽拉可以通過促進細胞的增殖來影響角膜成纖維細胞的生物學行為，這對損傷后角膜組織早期修復具有積極意義。如屈光手術后，少量的基質切削造成組織損傷的同時使角膜拉應力增大。在這種情況下，拉應力通過促進細胞增殖而有利于損傷后角膜組織的修復，這種行為是生物體自我保護的體現。

圖5 單軸周期性拉伸對角膜成纖維細胞遷移的影響

角膜損傷后上皮細胞分泌各種細胞因子和生長因子（如bFGF），并刺激淚腺分泌EGF。角膜成纖維細胞也可以產生各種生長因子并表達相應受體，其中包括bFGF和EGF及其受體。這些生長因子通過自分泌或旁分泌方式調節角膜成纖維細胞的增殖和遷移行為[12]。研究表明bFGF和EGF均可以促進角膜成纖維細胞遷移，并具有劑量依賴性[4-5]。實驗也證實施加100ng／mL bFGF或1ng／mL EGF 10h后明顯促進了兔角膜成纖維細胞的遷移。此外，bFGF及EGF還可以減弱由拉伸引起的細胞遷移抑制行為。如5%等雙軸拉伸20h，bFGF和EGF作用組相對劃痕寬度分別為（44.11±9.81）%和（51.66±5.31）%，與1%FBS靜態對照組的（46.24±3.91）%相當。這說明細胞生長因子bFGF和EGF能夠使角膜成纖維細胞在受拉狀態下保持適宜的遷移速度，從而有利于角膜的損傷修復。

本研究結果表明，5%、0.1Hz的周期性機械拉伸能夠抑制角膜成纖維細胞的遷移行為。這與Savla U等[8，13-14]的結果一致。周期性牽拉引起的氣道上皮細胞遷移行為受抑與FAK-JIP3-JNK（FAK：Focal Adhesion Kinase，局部粘附斑；JIP3：JNK-interacting protein 3，JNK相互作用蛋白3；JNK：c-Jun N-terminal Kinase，c-jun氨基末端激酶）信號途徑有關[13-14]。而對牛動脈血管內皮細胞施加5%、1Hz的雙軸周期性牽拉24h，用Transwell小室檢測細胞的遷移情況則發現，拉伸能夠促進動脈血管內皮細胞遷移，拉伸組遷移細胞數目是靜態對照組的1.83倍[9]。該研究結果與我們及U.Savla等的結論相反，這可能與細胞種類及體外檢測細胞遷移的方法有關。Transwell小室主要檢測細胞在三維基質環境中的遷移行為，細胞遷移的快慢除與細胞本身運動能力相關外，還與細胞分泌的降解細胞外基質的蛋白（如基質金屬蛋白酶）量有關。而細胞體外劃痕實驗，主要考察二維培養條件下細胞的運動變形能力。

此外，研究還發現角膜成纖維細胞的遷移行為與力學載荷的作用方式有關。單軸拉伸對角膜成纖維細胞的遷移行為抑制效應比等雙軸拉伸明顯。T.A.Hornberger等[15]發現等雙軸拉伸和單軸拉伸均可以使C2C12細胞的細胞外信號調節激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）和蛋白激酶B（protein kinase B，PKB／Akt）磷酸化水平增高，但僅等雙軸拉伸可以引起核糖體S6激酶（Ribosomal S6kinase，p70S6k）磷酸化，這提示細胞對不同方式力學刺激的信號響應機制不同。

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