鐵皮石斛谷氨酸脫羧酶基因的分離與生物信息學分析

張崗，胡本祥，李依民，張大為，郭順星

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鐵皮石斛谷氨酸脫羧酶基因的分離與生物信息學分析

張崗，胡本祥，李依民，張大為，郭順星

712046 西安，陜西中醫學院藥學院/陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室（張崗、胡本祥、李依民）；100193 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所（張崗、張大為、郭順星）

分離珍稀瀕危蘭科藥用鐵皮石斛谷氨酸脫羧酶（GAD）基因并進行生物信息學和表達分析。

采用 RT-PCR 和 RACE 技術獲基因 cDNA 全長；利用生物信息學軟件分析蛋白理化性質、結構域和三維建模等分子特性；用 DNASTAR 6.0 和 MEGA 4.0 分別進行氨基酸多序列比對和進化樹分析；借助實時定量 PCR 檢測基因表達。

分離到基因，cDNA 全長 1795 bp，編碼一條由 498 個氨基酸組成的多肽，分子量55.90 kD，等電點 5.32；DoGAD 蛋白不含跨膜域或信號肽，具有谷氨酸脫羧酶和磷酸吡哆醛依賴的脫羧酶結構域（17-443、37-381）；DoGAD 與植物 GADs 蛋白一致性為 69.5% ~ 78.8%，隸屬于 GADs 分子進化樹的植物類群；轉錄本在石斛葉和莖中相對表達量較高，分別為根中的 5.16 和 3.92 倍。

成功克隆得到鐵皮石斛谷氨酸脫羧酶基因全長，的表達特征暗示其可能在鐵皮石斛葉和莖中發揮重要的調控作用。

鐵皮石斛； 谷氨酸脫羧酶； γ-氨基丁酸； 計算生物學； 基因克隆

谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）是生物體中普遍存在的一類胞內酶，主要分布于細胞質中，以磷酸吡哆醛為輔因子催化谷氨酸轉化為一種四碳非蛋白質氨基酸，即 γ-氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA）[1]。GABA 被證實是哺乳動物中樞系統中一種重要的抑制性神經遞質，具有降血壓、調節內分泌、健腦安神等多種生理功效；GABA 在植物細胞逆境防御、氮素儲存、激素合成以及生長發育等過程中起重要作用[1]。在食品科學領域，GABA 正在作為新資源食品獲得廣泛關注[2]。

基因現已從矮牽牛[3]、擬南芥[4]、水稻[5]、煙草[6]、香蕉[7]和人參[8]等多種植物中獲得克隆和鑒定。植物 GAD 蛋白 C 末端普遍含有一個鈣調蛋白（calmodulin，CaM）結合域，能夠與 CaM 結合增加酶活。植物受低溫、高溫、高鹽或傷害等外源環境因子刺激時，胞內產生 Ca2+峰，進而結合 CaM 活化 GAD 蛋白，最終導致胞內積累大量GABA。擬南芥 GAD1 和 GAD2 酶活受 Ca2+/CaM 處理分別上調 35 倍和 13 倍，2基因受外源 NH4Cl、NH4NO3、谷氨酸等營養物處理誘導，參與調控植物氮代謝[4]。香蕉1 基因的表達與果實成熟及乙烯生物合成密切相關[7]。人參基因響應高鹽、高溫、H2O2等處理，可能在非生物逆境脅迫反應中起作用[8]。因此，GAD 介導的 GABA 合成途徑對調節植物體的生長發育和非生物逆境脅迫等生命活動至關重要。

鐵皮石斛（Kimura et Migo）為蘭科（Orchidaceae）石斛屬（）多年生草本植物，是石斛屬藥用植物中最為珍稀名貴的種。石斛屬植物主要含有多糖、芪類、酚類、氨基酸等活性成分，具有重要的藥理作用[9]。GABA 在石斛藥理功效方面的作用尚不清楚。前期，我們利用 SSH 技術富集鐵皮石斛種子共生萌發差異表達基因[10]，分離得到一條 587 bp 的表達序列標簽（expression sequence tag，EST），與蓖麻（）（GenBank 注冊號 XM_002528469）相似性較高（66%）。鑒于GAD 介導的 GABA 合成途徑在植物細胞生理代謝中的重要作用，該 EST 可能在鐵皮石斛細胞生理代謝中起作用。本研究利用 RACE 克隆基因全長并進行特征分析，旨為揭示其在鐵皮石斛細胞生理代謝中的生物學功能提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料和取樣 野生鐵皮石斛采自云南西雙版納。幼嫩石斛小苗處于營養生長階段，無花蕾，株高約（10 ± 2）cm，取其根、莖、葉等樣品，液氮速凍后置–80 ℃保存備用。

1.1.2 主要試劑 EASYspin 植物 RNA 快速提取試劑盒為 Aidlab 公司產品；M-MLV 逆轉錄試劑盒為美國 Promega 公司產品；SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit 和Advatange?2 Polymerase Mix 為日本 Clotech公司產品；膠回收試劑盒為 TianGen 公司產品；pMD18-T 載體、SYBR?PremixTMMaster Mix 和ROX 為日本Takara 公司產品；瓊脂糖購自美國Sigma 公司；其他化學試劑均購自美國 Gibco 公司。

1.1.3 實驗儀器 NanoDropTM2000 分光光度計為美國 Thermo Fisher 公司產品；PTC-200 型 PCR 儀為美國 Bio-Rad 公司產品；瓊脂糖電泳系統為北京六一公司產品；Gene GENIUS BIO IMAGING System 凝膠成像系統為Synegene 公司產品；熒光定量 PCR 儀和ABI PRISM 7500 SDS 軟件為美國 Applied Biosystems 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取和 cDNA 合成 按照 EASYspin 植物 RNA 快速提取試劑盒操作說明制備各樣品總 RNA，NanoDropTM2000 分光光度計分析 RNA 質量、純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。按照M-MLV 逆轉錄試劑盒操作說明，反轉錄合成cDNA 第一鏈，–20 ℃保存備用。

1.2.2 5'-RACE 和 RT-PCR 驗證 根據原始 EST序列，設計兩條 5'-RACE 引物：DoGAD-R1 5' GCC GTCGTTACCGCTTATCT 3'；DoGAD-R2 5' GCTTC TGCTAAAGTCTTCCCTG 3'，按照 SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit 說明書，分別與 Nested Universal Primer A（NUP）引物組合進行兩次巢式 5'-RACE。兩次 PCR 反應體系均為 25 μl。第一次 PCR 體系包括10 × Advantage?2 PCR buffer 2.5 μl，10 mmol/L dNTPs 0.5 μl，DoGAD-R1（10 μmol/L）0.5 μl，10 × NUP 0.5 μl，5'-RACE ready cDNA 1.0 μl，50 × Advatange?2 Polymerase Mix（5 U/L）0.5 μl，ddH2O 19.5 μl；反第二次 PCR 分別以0.5 μl DoGAD-R2（10 μmol/L）和1.0 μl 第一次 PCR 產物作為下游引物和反應模板外，其余組分與第一次 PCR 體系的保持一致。PCR 程序為：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共 32 個循環；72 ℃ 7 min，4 ℃保溫。PCR 產物經 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，以膠回收試劑盒純化目的條帶，連接至pMD18-T 載體，轉化大腸桿菌JM109 感受態細胞，隨機挑選3 個克隆送上海生工測序。所獲 cDNA 序列與原 EST 拼接，設計跨開放閱讀框（open reading frame，ORF）引物DoGAD-S1：5' TCTTGAGGTTGAGGGCGA 3'，DoGAD-AS1 5' TACTTACTCTCCCTATGACAAAC AG 3'，進行全長基因 RT-PCR 驗證。

1.2.3 序列分析 使用一系列網絡在線工具進行基因核酸及編碼蛋白的生物信息學序列分析。利用NCBI 的BLASTx（http://www.ncbi.nlm. nih.gov/blast/）和 ORF Finder（http://www.ncbi.nlh. nih.gov/gorf/gorf.html）分析cDNA 序列；用ExPASy Proteomics Server 的InterProScan（http://www.ebi. ac.uk/cgi-bin/iprscan/）和 PROSITE SCAN（http:// npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_proscan.html）分析DoGAD 蛋白質的結構域和基元；Protparam（http://web.expasy.org/protparam/）和 SOPMA（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_ sopma.pl）分析蛋白質理化性質和二級結構；采用SWISS-MODEL（http://swissmodel. expasy.org/）進行蛋白質三維建模分析；SignalP 4.0（http://www.cbs. dtu.dk/services/SignalP/）和TMpred（http://www.ch. embnet.org/software/TMPRED_form. html）預測蛋白質信號肽和跨膜區域；PSORT（http://psort.ims.u- tokyo.ac.jp/form.html）進行蛋白質亞細胞定位分析。采用 DNASTAR 6.0 進行氨基酸序列比對分析；借助MEGA 4.0 構建系統進化樹。

1.2.4 實時定量 PCR 分析 分別用2 μg 根、莖、葉樣品總RNA 反轉錄合成cDNA，1作為內參基因[11]，qPCR 分析基因的組織表達模式。qPCR 引物DoGAD-S2 5' TCAAAAGA CAGTGGAATGCCC3' 和DoGAD-AS2 5'TGCCG TCGTTACCGCTTAT3' 的擴增產物長 297 bp。用 PRISM 7500 實時熒光定量 PCR 儀進行qPCR。反應體系 25 μl，包括 2 × SYBR?PremixTMMaster Mix 12.5 μl，正反向引物（10 μmol/L）0.5 μl，ROX 0.5 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 9 μl。每個反應重復 3 次，包括不加模板的對照，實驗重復 3 次。PCR 程序為：95 ℃ 30 s，95 ℃10 s，60 ℃ 45 s，40 個循環，反應結束繪制熔解曲線。根據ABI PRISM 7500 SDS 軟件生成的循環閾值（cycle threshold，CT），用 2-ΔΔCT方法[12]計算相對表達量。

2 結果

2.1 DoGAD 基因克隆和全長驗證

經過兩次巢式 5'-RACE 反應，擴增產生長度約為 1500 bp 的目標條帶（圖 1），克隆、測序獲得 1412 bp 的序列，拼接得到一條 1795 bp 的 cDNA。BLASTx 分析表明其與 GenBank 中已注冊的多種植物谷氨酸脫羧酶基因有很高的相似性（73% ~ 80%），定名為（GenBank 注冊號 KF876841）。基因的開放閱讀框長 1497 bp，5'-UTR 長 128 bp，3'-UTR 長 142 bp，具有真核生物 polyA 尾巴，起始密碼子附近堿基序列 AATATGG 遵循 KOZAK 規則，即 A/GNNA TGG[13]。使用 DoGAD-S1/AS1 引物，RT-PCR 擴增產生單一條帶（圖 1），克隆、測序獲得 1584 bp 的序列包含完整 ORF，與拼接序列一致，進而說明已成功獲得基因全長。

kb M 1 2 M 2.001.000.750.500.250.10

Figure 1 Clone of the full length cDNA ofgene in

2.2 DoGAD 基因的編碼蛋白理化特性分析

Protparam 預測基因編碼蛋白分子式 C2516H3943N661O742S18，分子量為 55.90 kD，等電點 5.32；DoGAD 蛋白帶負電殘基（Asp + Glu）為 67，帶正電殘基（Arg + Lys）為 55。該蛋白不穩定系數為 38.27，脂肪系數為 92.59，親水性系數為–0.144。SOPMA 分析結果表明 DoGAD 蛋白二級結構有 204 個 α 螺旋（alpha helix，40.96%）和 78 個 β 轉角（beta turn，7.43%），兩者被 78 個延伸鏈（extended strand，15.66%）連接，還包含 179 個隨機卷曲（random coil，35.94%）。

2.3 DoGAD 蛋白結構域、定位和跨膜區分析

InterProScan 分析顯示，基因編碼蛋白含有保守的谷氨酸脫羧酶結構域（17-443）和磷酸吡哆醛依賴的脫羧酶結構域（37-381）。PROSITE SCAN 分析結果表明，DoGAD 蛋白包括 1 個cAMP/cGMP 依賴蛋白激酶磷酸化位點（491-494）、2 個 N 糖基化位點（272-275、317-320）、2 個蛋白激酶 C 磷酸化位點（361-363、394-396）、7 個酪蛋白激酶 II 磷酸化位點（66-69、68-71、292-295、387-390、428-431、462-465、472-475）、4 個酪氨酸激酶磷酸化位點（182-188、145-152、82-90、144-152）和 6 個 N-豆蔻?；稽c（122-127、125-130、211-216、279-284、357-362、463-468），這些保守基元可能對蛋白結構和功能有重要作用。SignalP 4.0 和TMpred 分析DoGAD 蛋白不含信號肽和跨膜域。PSORT 預測DoGAD 蛋白定位于線粒體基質的可能性較高，為 48%，過氧化物酶體次之為 34.5%，定位于細胞核、線粒體內膜的幾率分別為 30% 和 18.8%。

2.4 DoGAD 編碼蛋白三維建模

在 SWISS-MODEL 依據保守結構域作圖工具中，以擬南芥谷氨酸脫羧酶 AtGAD1（PDB No.: 3HBX）A 鏈為模板[14]，對 DoGAD 蛋白進行三維結構建模（圖2），結果顯示 DoGAD 與該蛋白有 84.86% 的序列相似性，空間結構類似。

圖 2 基于 SWISS-MODEL 的 DoGAD 蛋白三維建模

Figure 2 Three-dimensional structure of the deduced DoGAD protein using SWISS-MODEL

2.5 DoGAD 與植物 GADs 蛋白的氨基酸序列比對分析

運用 DNAStar 6.0 中的 MegAlign 程序，對 DoGAD 蛋白與 6 條植物 GAD 蛋白進行多序列比對（圖 3）。結果表明，DoGAD 與人參PgGAD（ADB82905）的一致性最高為 78.8%，擬南芥 AtGAD1（NP_197235）次之，為 78.5%，與水稻OsGAD1（BAB32870）、AtGAD2（NP_001117556）、蒺藜苜蓿 MtGAD（XP_003600653）和OsGAD2（BAB32869）等蛋白的一致性分別為 78.1%、77.1%、77.1% 和 69.5%。同時，DoGAD蛋白與其他植物 GADs 有相似的保守區域及活性位點（圖 3A，242-293），包含磷酸吡哆醛結合位點（圖 3B，274-277）以及由 32 個氨基酸組成的鈣調蛋白結合 C 末端延伸區域。

Figure 3 Multiple sequence alignment of DoGAD and GADs proteins from other plants (A: The active domain of GADs; B: The consensus motif for the binding of pyridoxal 5-phophate; C: The C-termial peptide extension)

圖 4 DoGAD 與不同物種 GADs 蛋白的進化樹分析

Figure 4 Phylogenetic tree of DoGAD with GADs from other species

2.6 DoGAD 基因編碼蛋白的系統進化樹分析

為分析基因編碼蛋白的進化關系，從 GenBank 數據庫中選取來自微生物、動物和植物中具有代表性的 13 個物種 GADs 蛋白序列，利用 MEGA 4.0 構建 DoGAD 蛋白的系統進化樹。圖 4 結果表明，17 條 GADs 被聚成動物、微生物和植物三大類群；鐵皮石斛 DoGAD 蛋白隸屬于植物類群，符合植物自然進化過程。

2.7 基因表達模式分析

分別提取石斛根、莖、葉等樣品總 RNA，利用 qPCR 技術檢測基因的組織表達模式。圖 5 結果表明，基因轉錄本在 3 種組織中為組成型表達，但相對表達量存在明顯差異。以根為校正樣本，基因轉錄本在葉中的表達量最高，為根中的 5.16 倍，莖中表達量為根中的 3.92 倍。

相對表達量Relative expression6543210 根 葉 莖 Root Leaf Stem

Figure 5 Tissue-specific expression pattern ofgeneusing qPCR analysis

3 討論

通過指導 GABA 的合成代謝調控植物體生長發育、抗病以及非生物逆境脅迫等多種生命活動過程。基因特性已在矮牽牛[3]、擬南芥[4]、水稻[5]和煙草[6]中深入報道，藥用植物中僅有人參[8]的相關分析。植物一般呈多基因家族，序列比對顯示擬南芥基因組中有 5 個成員[15]，煙草和水稻中有 2 個[6, 8]，人參以多拷貝形式存在[8]。本研究首次從珍稀瀕危藥用鐵皮石斛中分離到一個基因，編碼蛋白具有谷氨酸脫羧酶的保守結構域。DoGAD 與多種植物GADs 蛋白序列相似性較高，二級結構與西洋參、矮牽牛和擬南芥等植物的類似[8]，三維結構和AtGAD1 蛋白 A 鏈晶體結構類似[14]，隸屬于 GADs 蛋白進化樹三大類群的植物類群。這些結果說明是編碼鐵皮石斛谷氨酸脫羧酶的新基因。

結構域和基元是決定蛋白質生物學功能的重要因素。DoGAD 蛋白的 SGHK 基序符合植物GADs 磷酸吡哆醛結合位點的序列特征 Ser-X-X- Lys[8]，賦予其結合磷酸吡哆醛的特性。DoGAD 羧基端具有CaM 結合域，且其中包含對CaM 結合至關重要的色氨酸殘基[16]（第 484 位的 W），說明該蛋白是Ca2+/CaM 依賴的 GAD，與幾乎所有植物 GADs 的研究結果一致[3-8]，有別于Ca2+/CaM 不依賴的OsGAD2，因 OsGAD2 的 CaM 結合域存在較多氨基酸變異[5]。DoGAD 蛋白不含分泌或跨膜肽段，說明其為胞內蛋白，在植物細胞內起作用。植物 GADs 介導的 GABA 合成途徑在細胞質中進行[1]，PSORT 關于 DoGAD 的亞細胞定位預測與此并不一致，尚有待于進一步實驗分析。

基因表達研究表明基因普遍存在于多種植物組織中，在植物發育、外界刺激及果實成熟等不同的生理過程中差異表達。本研究 qPCR 分析顯示，基因為組成型表達，在石斛葉和莖中相對表達量較高，暗示其可能主要調控葉和莖中 GABA 的合成。在半夏[17]、炒稻芽和炒麥芽[18]等中藥材中，GABA 是一種主要的活性成分，其合成代謝可能與 GAD 基因表達調控密切相關。GABA 作為重要的神經中樞調節物質，已經在醫藥和食品領域展現了廣闊的應用前景。后續隨著基因功能的解析、GABA 合成代謝及其藥理活性關系的闡明，將有利于通過遺傳工程改良鐵皮石斛種質，進而為石斛屬植物的資源開發與利用奠定物質基礎。

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Isolation and bioinformatics analysis of a glutamate decarboxylase gene in

ZHANG Gang, HU Ben-xiang, LI Yi-min, ZHANG Da-wei, GUO Shun-xing

This study is aimed to isolate and characterize a glutamate decarboxylase (GAD) genefrom, a rare endangered medicinal orchid species.

RT-PCR and RACE technologies were used for gene isolation. The physiochemical properties, conserved domains and three dimensional structure of the deduced DoGAD protein were determined using a series of bioinformatics tools. The analyses of multiple alignment and phylogenetic tree were performed using DNASTAR 6.0 and MEGA 4.0, respectively. Real time quantitative PCR was used for gene expression analysis.

The full-length cDNA of, with 1795 bp in size, was deduced to encode a 498-aa protein with molecular weight of 55.90 kD and isoelectric point of 5.32. The deduced DoGAD protein, without transmembrane or signal peptide residues, contained glutamate decarboxylase and pyridoxal phosphate dependant decarboxylase domains (17-443, 37-381). DoGAD had high identities (69.5% - 78.8%) with a number of GAD proteins from various plants, and was grouped into the Plant subgroup in the evolutionary tree of GADs. The transcript abundance ofwas markedly higher in the leaves and stems than that in the roots, which was about 5.16 and 3.92 fold, respectively.

The full length cDNA ofwas successfully cloned. Its expression pattern suggests thatmay play an important regulatory role in the leaf and stem of.

; Glutamate decarboxylase; Gamma-aminobutyric acid; Compatational biology; Gene clone

GUO Shun-xing, Email: sxguo1986@163.com

國家自然科學基金（31070300、31101608）；陜西省青年科技新星項目（2012KJXX-44）；陜西省教育廳專項科研計劃項目（2013JK0829）

郭順星，Email：sxguo1986@163.com

2013-12-15

Author Affiliations: College of Pharmacy and Shanxi Provincial Key Laboratory for Chinese Medicine Basis & New Drugs Research, Shanxi University of Chinese Medicine, Xi’an 712046, China (ZHANG Gang, HU Ben-xiang, LI Yi-min); Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China (ZHANG Gang, ZHANG Da-wei, GUO Shun-xing)