自體樹突狀細胞聯合抗病毒藥治療HBeAg陽性慢性乙型肝炎臨床效果研究

金國賢，孫斌，金碩，曲連軍，張瑜

目前對乙型肝炎慢性化的傳統治療方法多采用恩替卡韋等抗病毒藥物，通過降解病毒 mRNA直接抑制肝細胞中的病毒復制，并間接刺激免疫系統，但病毒的清除率較低，而其他抗病毒藥物雖有效抑制病毒復制但持續時間短，易出現反彈[1]。樹突狀細胞（dendritic cell，DC）能夠刺激機體針對外界病原體的入侵產生足夠的免疫反應，我院在傳統抗病毒治療的基礎上聯合自體 DC 對 HBeAg陽性的慢性乙型肝炎（CHB）進行治療并與單純抗病毒治療效果進行對比，探討聯合自體 DC 治療效果是否優于單純抗病毒藥物，結果報告如下。

1 對象與方法

1.1 對象與材料

1.1.1 研究對象及分組 選擇 2010年 8月 –2012年 7月間在我院肝炎門診確診的 HBeAg 陽性的 CHB 患者 126 例，17～56 歲，平均 30.2 歲，其中男性 82 例、女性 44 例，CHB 病程 1 ～9年，平均 3.7年，患者持續 HBsAg、HBeAg 及HBV DNA 陽性，其定量高于 105拷貝?ml，ALT >80 IU/L，不合并肝硬化和其他肝炎病毒感染及其嚴重并發癥。126 例患者隨機分為治療組 75 例和對照組 51 例，兩組生化指標和 HBV DNA指標相似。治療組獲得本院倫理委員會批準[批準號2010.07 倫審第（32）]和患者簽署的知情同意書，采用自體 DC 聯合恩替卡韋治療，對照組僅用恩替卡韋治療。

1.1.2 實驗試劑 RPMI 1640 培養液、rhGM-CSF、rhIL-4、TNF 購自達科為生物科技有限公司；鼠抗人 CD80、CD86、HIA-DR 購自北京利文生物科技有限公司。

1.1.3 實驗儀器 倒置顯微鏡為日本 Olympus公司產品；CO2培養箱為日本三洋公司產品；流式細胞儀和細菌培養儀均為美國 BD 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 DC 細胞的獲得 無菌條件下抽取患者靜脈血 50 ml，肝素抗凝。用蘸有 75% 酒精的紗布擦拭靜脈血容器拿至生物安全柜內，鹽水 1∶1 稀釋抗凝血，緩慢加入淋巴細胞分離液，2000 r/min 離心 20 min，分離單個核細胞吸取細胞層后稀釋，用1600 r/min 離心 11 min，去上清計數，重混勻稀釋1000 r/min 洗滌 2 次。將（1～2）× 106/ml濃度的細胞移至 75 cm2的培養瓶。于 37 ℃，50 ml/L CO2飽和濕度下培養 3 h，棄上清液加 1640 培養液清洗 2～3 次，去除懸浮細胞，加入有 CSF 和 rhIL-4的培養基，隔日換液，培養至第 6 天加入 HBsAg，4 h 后加入 TNF。繼續 37 ℃，50 ml/L CO2飽和濕度下培養 1 d，收獲 DC 細胞，用生理鹽水沖洗后 1200 r/min 離心 10 min，棄上清用鹽水重懸細胞洗滌 2 次后留樣，進行細胞計數、細胞活性以及無菌檢測以及流式細胞檢測。

1.2.2 治療方法和觀察指標 兩組均采用口服恩替卡韋 0.5 mg/d，治療組在此基礎上給予 DC 治療。于皮下注射和靜脈輸注體內 DC 懸液各 1 ml，連續 3 個月。兩組患者于治療前和治療后 6 個月檢測肝功生化指標和 HBV-DNA 滴度含量，進行比較。

1.3 統計學處理

應用 SPSS19.0 統計軟件分析，兩組治療前后及兩組間比較采用 t 檢驗和 χ2檢驗，P < 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DC 體外培養擴增

外周血單核細胞貼壁 4 h 后獲得黏附細胞，加入細胞因子 24 h 后貼壁細胞減少，懸浮細胞逐漸增多，培養時間延長至第 6 天呈積聚現象，并可見到細胞具有樹突樣突起，臺盼藍染色細胞存活率達 95% 以上，細胞計數平均達到 1×107個/ml。

圖1 DC 細胞形態（A：4 h，× 200；B：6 d，× 400；C：7 d，× 400）Figure1 Image of cultured dendritic cells (A: 4 h,×200; B: 6 d,×400; C: 7 d,×400)

圖2 CD80+/CD86+ 流式檢測對照圖Figure2 CD80+/CD86+ flow cytometry control image

圖3 CD80+/CD86+ 流式檢測圖Figure3 CD80+/CD86+ flow cytometry image

圖4 CD80+/HLA-DR流式檢測對照圖Figure4 CD80+/HLA-DR flow cytometry control image

圖5 CD80+ /HLA-DR 流式檢測圖Figure5 CD80+ /HLA-DR flow cytometry image

2.2 HBsAg 致敏 DC 細胞

培養至第 6 天，加入 HBsAg 4 h 后再加入TNF 繼續培養 1 d。收獲前細胞形態如圖 1 所示。

2.3 成熟 DC 細胞的特征標志

收獲的 DC 細胞進行流式細胞儀檢測 DC 表面 CD80、CD86、HLA-DR 的表達，見圖 2～5。

治療 6 個月后，治療組和對照組 ALT 和AST 均降到了正常范圍，HBeAg/抗-HBe 血清轉換率分別為 30.62%（23/75）和 21.4%（11/51）。經 χ2檢驗 P < 0.05（表 1）。

治療后 6 個月，治療組和對照組 HBV-DNA滴度分別為（0.500 ± 0.06）× 103拷貝/ml 和（1.400± 0.12）× 103拷貝/ml，兩者差異有統計學意義（表 2）。

表1 治療前后兩組生化指標測定比較（U/L）Table1 Comparison of biochemical parameters after treatment (U/L)

表2 治療前后兩組 HBV-DNA 測定結果的比較（拷貝/ml）Table2 Comparison of HBV-DNA after treatment (copies/ml)

3 討論

樹突狀細胞是人類最重要的抗原提呈細胞，促進細胞免疫的功效是其他抗原提呈細胞的數十倍[2]。免疫功能不全，機體對感染的 HBV 處于持續免疫耐受狀態是乙型肝炎慢性化的主要原因之一[3]。

HBeAg 陽性慢性乙型肝炎（CHB）具有病程短、炎癥活動明顯、病毒復制活躍，患者相對年輕等特點[4-5]。以往對 HBeAg 陽性慢性乙型肝炎的治療多采用 α-干擾素和乙肝病毒復制抑制劑如恩替卡韋、拉米夫定等藥物，短時期對病毒有一定的抑制作用，但長期服用易導致抗藥性突變體的發生，病毒復制量反彈，宿主的免疫系統未能得到根本的改善和調節，不能產生有效的細胞毒性 T 細胞（CTL）效應[6-7]。

樹突狀細胞是起源于骨髓的最強的專職抗原遞呈細胞，具有啟動 T 細胞介導的免疫應答功能，對體內靜息 T 細胞激活效率最高[8]。研究表明樹突狀細胞還具有增強 NK 細胞的功能[9-10]。近年來研究表明，造成慢性肝炎免疫耐受的原因是患者體內樹突狀細胞抗原遞呈功能缺陷，不能把病毒抗原的信號傳遞給機體的免疫系統。近幾年對樹突狀細胞的免疫功能的研究有了很大的進展，特別是體外培養慢性乙型肝炎患者的樹突狀細胞已應用于臨床[11]。本項研究在應用恩替卡韋抗病毒藥物治療的同時，聯合自體樹突狀細胞，對 75 例 HBeAg 陽性的慢性乙型肝炎患者進行治療，并與單純應用恩替卡韋治療的對照組進行對照，結果發現治療組在降低 HBV-DNA 滴度方面明顯優于對照組，提示自體 DC 具有抑制患者體內病毒復制，降低血清病毒載量作用，經過體外培養的 DC 可增強慢性乙型肝炎患者免疫功能，達到抑制 HBV 病毒的作用。

HBeAg 血清學轉換率是目前診斷慢性 HBV感染者免疫系統控制 HBV 感染能力和接近臨床治愈狀態的評價指標之一[12]。本項研究治療組HBeAg 血清學轉換率（30.62%）高于對照組（21.4%），提示自體樹突狀細胞不僅能降低HBV-DNA 載量，改善肝臟功能，也能提高 HBeAg血清學轉換率。治療組和對照組 ALT 和 AST 三個月均降至正常范圍，兩組無顯著差異。

本項研究結果表明恩替卡韋聯合自體 DC 可增強慢性乙型肝炎患者的免疫力，并對病毒復制具有明顯抑制作用，能夠提高 HBeAg 血清轉換率。遠期療效有待進一步隨訪觀察。

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