工程酵母細胞高壓破碎、蛋白低溫保藏和去糖基化處理對7-木糖紫杉烷糖基水解酶LXYL-P1-2活性的影響

陳天嬌，朱平

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工程酵母細胞高壓破碎、蛋白低溫保藏和去糖基化處理對7-木糖紫杉烷糖基水解酶LXYL-P1-2活性的影響

陳天嬌，朱平

100050 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室/國家衛生和計劃生育委員會天然藥物生物合成重點實驗室

紫杉醇主要來源于紅豆杉，作為一種“重磅炸彈”式的抗腫瘤藥物，自 1992 年 12 月被美國 FDA 批準上市以來，一直是銷售額最大的植物抗腫瘤藥。但由于紫杉醇的天然含量極低，約占含量最高的樹皮部位的萬分之二，加之紅豆杉生長緩慢，早期從野生紅豆杉中獲取紫杉醇曾給紅豆杉資源造成毀滅性破壞。目前主要依靠化學半合成或苗圃栽培手段制取。苗圃栽培雖然對保護野生紅豆杉資源具有積極意義，但栽培紅豆杉中紫杉醇含量低微的本質沒有發生改變。另一方面，紅豆杉中存在著大量的紫杉醇結構類似物，其中包括含量數十倍于紫杉醇的 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇，而后者在脫除木糖基之后形成的 10-去乙酰紫杉醇僅需在 C10 位乙酰化即可產生紫杉醇[1]。如能將這類副產物轉變成紫杉醇，不僅可以減少其對環境的污染，還可以“變廢為寶”，大大提高紅豆杉資源的利用率。脫除木糖基可用化學法或生物酶法來完成，其中后者的專一性強、環境友好。但由于天然細胞中 β-木糖苷酶的酶量普遍偏低，用篩選得到的微生物直接進行轉化效率不高[2-3]，本實驗室已嘗試用基因工程方法解決這一問題。我們已從具有轉化 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇為 10-去乙酰紫杉醇能力的真菌香菇中克隆得到了 7-木糖紫杉烷糖基水解酶 LXYL-P1-2，該酶隸屬于糖基水解酶的第 3 家族，是一種全新的和雙功能的 β-木糖苷酶和 β-葡萄糖苷酶，能高效且專一性地水解包括 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇在內的 7-木糖紫杉烷的木糖基，生成相應的 7-羥基紫杉烷。已對該酶及其重組菌開展了酶的表征、高密度發酵與生物催化等研究[4-6]。本文報告工程酵母細胞高壓破碎條件、蛋白低溫保藏和去糖基化處理對 LXYL-P1-2 酶活性的影響，為利用純化的重組酶進行酶結構與功能關系等的研究提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 重組畢赤酵母 GS115-3.5K-P1-2 由本實驗室構建。

1.1.2 試劑與溶液 β-木糖苷酶通用的生色底物對硝基苯基-β-D-木糖苷（p-nitropheny-β-D-xylopyranoside，PNP-Xyl）和標準牛血清蛋白（BSA）均購自美國 Sigma 公司；蛋白酶抑制劑 Cocktail Set III（無EDTA）購自美國 Merck Millipore 公司；糖苷內切酶Endo Hf 購自美國 New England BioLabs 公司；蛋白定量染色液購自美國 Bio-Rad 公司；配制以下蛋白純化溶液：

Buffer A：2 ml 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）、25 ml 2 mol/L KCl、2 ml 1 mol/L 咪唑、69.44 μl 14.4 mol/L β-巰基乙醇、10 ml 甘油，加蒸餾水定容至 100 ml；

Buffer B：2 ml 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.5）、5 ml 2 mol/L KCl、69.44 μl 14.4 mol/L β-巰基乙醇、10 ml 甘油，加蒸餾水定容至 100 ml；

Buffer C：2 ml 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.5）、5 ml 2 mol/L KCl、69.44 μl 14.4 mol/L β-巰基乙醇、10 ml 甘油，加蒸餾水定容至 80 ml；

各種濃度的咪唑洗脫液：用 Buffer C 作為溶劑對1 mol/L 咪唑進行稀釋獲得。

1.1.3 設備與儀器 APV-2000 型高壓細胞破碎儀購自德國 SPX 公司；P300 型超微量分光光度計購自德國Implen 公司；鎳親和層析填料購自美國 GE Healthcare 公司；島津Labsolution 分析型高效液相工作站購自日本 Shimadzu 公司；電熱恒溫水箱購自北京長風公司；FE 20 型 pH 計購自瑞士 Mettler 公司；Zorbax Bio Series GR-450 分離柱購自美國 Agilent 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞破碎條件優化

1.2.1.1 菌體處理和細胞破碎 取 20 g 冷干后的 GS115-3.5K-P1-2 菌體粉末浸泡于 140 ml 的 Tris-HCl（20 mmol/L，pH 8.0）緩沖液中，并加入 700 μl 蛋白酶抑制劑，充分混勻。待系統冷卻到 4 ℃后，120 MPa 壓力條件下對 GS115-3.5K-P1-2 酵母細胞進行高壓破碎，分別在破碎 5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 次時取樣。13 500 ×離心 30 min，檢測上清液的木糖苷酶活性性并對目的蛋白進行分離純化。

1.2.1.2 酶活力測定方法 取 10 μl 蛋白上清液與 50 μl 5 mmol/L PNP-Xyl 混勻，50 ℃、pH 5.0 條件下反應 20 min 后加入 1 ml 飽和硼酸鈉終止反應，405 nm 波長處檢測吸光值。

1.2.1.3 鎳親和層析法初步純化 LXYL-P1-2 蛋白 高壓破碎后的上清液用 0.45 μm 濾膜過濾，每份樣品約 15 ml 初始蛋白液。鎳親和層析過程以 2 ml/min 流速進行，首先用 60 ml 去離子水沖洗 20 ml 鎳親和層析柱，再用 60 ml Buffer A 平衡鎳親和層析柱，平衡后將 15 ml 蛋白樣品全部上樣，用 100 ml Buffer A 沖洗純化柱，用 100 ml Buffer B 繼續沖洗純化柱。配制不同濃度的咪唑洗脫液，分別用 60、200 mmol/L 咪唑對目的蛋白進行洗脫，每個濃度洗脫 60 ml，通過活性跟蹤的方法收集 60 mmol/L 咪唑濃度下的目的蛋白洗脫組分[7]，并用孔徑為 30 kD 的超濾管于 4000 ×條件下進行濃縮。

1.2.1.4 制備型高效液相色譜純化 LXYL-P1-2 蛋白 超濾濃縮后的蛋白樣品用0.45 μm 的濾器過濾，備用。首先用含 0.1 mol/L 氯化鈉的 0.1 mol/L 磷酸鉀緩沖液（pH 8.0）作為流動相平衡 Agilent Zorbax Bio Series GF-450 分離柱，流速 1 ml/min，30 min。每次上樣 500 μl 后用上述緩沖液以 0.5 ml/min 的流速沖洗柱子，220 nm 波長檢測條件下收集活性峰。

1.2.1.5 測定純化后的 LXYL-P1-2 蛋白濃度 以 Bradford法檢測目的蛋白濃度。用去離子水將 BSA 配成 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/ml 濃度梯度溶液，以去離子水為空白對照。分別取 100 μl 各濃度 BSA 溶液和待測樣品溶液到干凈試管中，平行做兩管，加 5 ml 染色液（用去離子水將母液稀釋 5 倍，預先混勻，現配現用），混勻。室溫放置 10 min 后，紫外可見分光光度計 595 nm 波長檢測，得到 BSA 蛋白濃度的標準曲線，讀出待測樣品的蛋白濃度。

1.2.1.6 LXYL-P1-2 比活力測定 LXYL-P1-2 酶活力單位（U）定義為：在 50 ℃，pH 5.0，以PNP-Xyl 為底物的條件下，每分鐘產生 1 nmol 對硝基苯酚所需要的酶量。按照 1.2.1.2 的方法測定酶活性。根據 Lambert-Beer 定律，吸光值= εbc[ε：摩爾消光系數，對硝基苯酚的摩爾消光系數為 17 500 L/(mol·cm)；b：比色皿寬度，為 1 cm；c：吸光物質摩爾濃度]，因此在上述總體積為 1.060 ml 的反應體系中，單位體積 LXYL-P1-2 的酶活力（U/ml）=405× 302.86。LXYL-P1-2 糖基化蛋白的分子量約為 120 kD，根據測得的蛋白質量濃度，求出單位為 U/μmol 的酶比活力。

1.2.2 LXYL-P1-2低溫保藏效果檢測 測定制備純化后 LXYL-P1-2 蛋白的木糖苷酶活力，將部分蛋白溶液分別于 4、–80 ℃下保存 35、70 d，測定低溫保藏后的酶活力并與保藏前的數據相比較，明確 LXYL-P1-2 蛋白低溫保藏的效果。

1.2.3 去糖基化對 LXYL-P1-2 酶活力的影響 LXYL-P1-2 的去糖基處理參考文獻[4]進行。取部分 1.2.2 中獲得的鎳親和層析后的蛋白溶液，經 30 kD 的超濾管在 4000 ×條件下將其濃縮到 2 mg/ml，用糖苷內切酶 Endo Hf 在 37 ℃條件下對 LXYL-P1-2 進行去糖基化處理 12 h，LXYL-P1-2 去糖基反應體系：2 mg/ml 的 LXYL-P1-2 蛋白樣品 400 μl，與 50 μl 10 × G5 Buffer 和 25 μl Endo Hf 混合，加水補齊總體系到 500 μl。

分別以未經上述處理的 LXYL-P1-2 和不加 Endo Hf、但同樣在 37 ℃條件下孵育 12 h 的 LXYL-P1-2 作為對照。去糖基之后的 LXYL-P1-2 經質譜分析，其分子量約為 92 kD（說明仍有部分糖基殘留）[4]。根據測得的蛋白質量濃度，求出單位為 U/μmol 的比活力。

2 結果

2.1 GS115-3.5K-P1-2 酵母細胞破碎研究

如圖 1 所示，通過對不同破碎次數的樣品上清液和純化后的目的蛋白進行活性測定，發現菌液在破碎 10 次的情況下上清液中的單位體積酶活力達到最大值，而比活力與破碎 5 次的樣品基本相似且與用試劑盒提取的純酶比活力相當（試劑盒提取的純酶比活力約為 4.5 × 104U/mg，相當于 5.3 × 106U/μmol）。在破碎 20、30、40 次情況下，盡管隨著破碎次數的增加總蛋白釋放量可能有所增加，但單位體積酶活力基本保持與破碎 10 次的一致，而比活力則一直在降低。之后，隨著破碎次數的增加，單位體積酶活力和比活力均急劇下降，到破碎 80 次時酶活力所剩無幾。分析原因，可能是由于隨著細胞破碎次數的增加造成酶溶液所處的溫度不斷上升，從而導致酶變性失活增加。破碎 10 次后細胞已基本破碎完全，綜合上述結果最終確定了破碎 10 次作為 APV-2000 型高壓細胞破碎儀的最佳破碎條件。

單位體積酶活力（× 102 U/ml）9.0 7.5 6.0 4.5 3.0 1.5 0.06.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0酶比活力（× 106 U/μmol） 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 破碎次數

2.2 LXYL-P1-2 純酶溶液長時間低溫保藏效果研究

將純化后的 LXYL-P1-2 純酶溶液分別置于 4 ℃和–80 ℃保存。結果如圖 2 所示，保存 35 d 后，在 4 ℃條件下酶活力降低了 19.7%，而在–80 ℃條件下僅下降了 4.5%；當同樣的蛋白樣品在–80 ℃保存天數達到 70 d 時，酶活力降低了 18.1%。說明LXYL-P1-2 純酶溶液保存在–80 ℃時一般不宜超過 35 d，此段時間內可保持酶活力的穩定。另外，長期低溫保藏 LXYL-P1-2 蛋白應選擇其粉末形式。

酶比活力（× 106 U/μmol）6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 初始值 4 ℃ –80 ℃ –80 ℃35 d 35 d 70 d 儲存條件

2.3 去糖基化對 LXYL-P1-2 酶活力的影響

前期研究發現，去糖基的 LXYL-P1-2 蛋白是有活性的，后續的蛋白結晶研究也主要是用其去糖基的形式。然而，糖基的有無究竟對該蛋白的活性有多大影響一直缺乏實驗依據。本實驗在對糖基化的 LXYL-P1-2 蛋白進行37 ℃、12 h 溫育（不加 Endo Hf）的同時，在相同溫度和時間條件下用 Endo Hf 水解 LXYL-P1-2 以制備去糖基的 LXYL-P1-2 蛋白。實驗結果如圖 3 所示，糖基化的 LXYL-P1-2 蛋白經過 37 ℃、12 h 溫育后活性下降了約 3.9%，而去糖基的 LXYL-P1-2 則下降 4.6%，兩者相差 0.7%，說明，LXYL-P1-2 蛋白糖基化與否不會對其活性產生實質性的影響，在去糖基處理過程中該蛋白活性的輕微下降，推測是由于 37 ℃條件下極小量蛋白變性失活所致。

酶比活力（× 106 U/μmol）5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 對照 37 ℃ 12 h 去糖基 處理方法

3 討論

在提取紫杉醇的過程中，作為副產物的7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的收率可達 0.5% 以上[8]，是紫杉醇的幾十倍。LXYL-P1-2 能高效、專一性地從 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇上脫去木糖基生成 10-去乙酰紫杉醇，因此，LXYL-P1-2 在7-木糖-10-去乙酰紫杉醇“變廢為寶”的過程中能夠發揮十分重要的作用，有必要對其開展深入的研究。

在對 LXYL-P1-2 進行酶學特性以及結構與功能關系的研究過程中，高純度且保持活性的酶蛋白是開展相關研究的物質基礎和前提條件。重組酵母 GS115-3.5K-P1-2 通過胞內表達及非分泌形式產生重組酶蛋白 LXYL-P1-2（注：即使通過分泌型載體如 pPIC9K 將該基因導入畢赤酵母，重組蛋白仍主要滯留在酵母細胞內），因此，細胞破碎是制備該蛋白的第一步，相比用試劑盒進行細胞破碎，高壓細胞破碎儀對細胞的破碎更為徹底且收率更高[9]。本實驗對細胞破碎效果的研究表明，用 APV-2000 型高壓細胞破碎儀進行細胞破碎時，最適破碎次數為 10 次，此時的蛋白釋放量和蛋白活性均保持在接近最高的水平。

在得到高純度的 LXYL-P1-2 蛋白之后，適當的保藏方法可以有效保持其活性，便于開展后續的研究。通過對純化后的 LXYL-P1-2 蛋白溶液進行低溫保藏的研究發現，在 –80 ℃保存 1 個月的時間內 LXYL-P1-2 的催化活性可以基本保持不變，當保存 2 個月之后，大約有 18% 的蛋白變性失活。當然，對于更長時間的酶蛋白保藏而言，用冷干的酶蛋白粉末結合低溫保藏應能確保該酶不喪失其活性。在進行 LXYL-P1-2 晶體形成及三維結構研究中，發現糖基化的 LXYL-P1-2 蛋白很難獲得高分辨率的蛋白晶體，而應用去糖基的 LXYL-P1-2 蛋白則最終解決了這一難題。前期實驗已證明去糖基的 LXYL-P1-2 蛋白仍具有酶活性，本實驗再次證明，LXYL-P1-2 蛋白糖基的有無不影響其活性，只是在去糖基過程中 37 ℃溫度條件可能會造成極小量酶蛋白的變性失活，但這對于后續的相關研究不會造成實質性的影響。

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國家自然科學基金（30770229、31270796）；“重大新藥創制”國家科技重大專項（2012ZX09301002-001-005）；中央高校基本科研業務費專項資金（2012N06）

朱平，Email：zhuping@imm.ac.cn

2014-04-08

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.05.013