細胞的遷移性，趨化性和侵襲性的檢測方法

Hilary Sherman，Pilar Pardo，Todd Upton

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細胞的遷移性，趨化性和侵襲性的檢測方法

Hilary Sherman，Pilar Pardo，Todd Upton

200040 上海，康寧生命科學亞洲技術中心

細胞的遷移性，是指細胞受到外來信號的刺激，由一個地方遷移到另一個地方的特性，通常發生在比如傷口愈合、細胞分化、胚胎發育和腫瘤轉移的過程中。細胞的侵襲性和遷移性相似，但不同的是，發生侵襲時，細胞需要降解一層胞外基質（ECM）或者基底膜基質（BME）進而遷移到一個新的地方。當正常細胞發生炎癥反應，或者腫瘤細胞發生轉移時都需要細胞的侵襲性。由此可見，了解這些特性的發生機制，對整個生物學研究有著重要而深遠的意義。

由康寧公司研發的 transwell 培養設備的出現，為在體外研究細胞的趨化性和侵襲性提供了一種相對簡便的方法。通常的侵襲檢測系統是由膠原蛋白、纖連蛋白、層黏連蛋白等復雜的胞外基質和基底膜基質組成。還有更復雜的檢測手段是在復合蛋白層膜上培養單層表皮細胞。將分泌多種生長因子的細胞培養在可滲透層膜上作為趨化源的系統，也可以用于趨化性檢測或者更繁雜的侵襲性檢測。

下面所述的方法步驟是基于 BME 層膜的細胞侵襲性檢測，附以趨化性檢測為例（對于不含 BMC 和 ECM 層膜的侵襲性檢測也遵循類似的方法）。這里具體列出了以康寧 96 孔transwell 設備為例的實驗參數。對于不同規格的系統可以根據下面表格中的數據調整材料或試劑的用量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 非侵襲性 MCF-7 細胞系（人類乳腺癌細胞）、侵襲性 HT1080 細胞系（人類纖維肉瘤細胞）均購自美國 ATCC。

1.1.2 檢測平板類型 8 μm 孔徑的 96 孔 HTS transwell 培養系統、96 孔黑板、96孔黑色固相微型板、8 μm 孔徑的 6 孔transwell 培養系統、12 μm 孔徑的 12 孔 transwell 培養系統、8 μm 孔徑的 24 孔 transwell 培養系統、超低黏附 6 孔和 24 孔平板均為康寧公司產品。

1.1.3 試劑 5 × 基底膜提取物（BME）包被溶液、10 × 包被緩沖液、10 × 細胞裂解液均為美國 Trevigen 公司產品；用來消化收集細胞的HyQtase 消化液購自美國 Hyclone 公司；Calcein AM 鈣熒光素乙酰氧基甲酯（分子探針）以 1.67 μg/ml 的濃度溶解在 DMSO 中；含有 10% 胎牛血清的 IMDM 培養基、不含血清但含有 1 × ITS 的 IMDM 培養基購自美國 Invitrogen 公司。

1.1.4 設備 實驗所需主要設備有37 ℃二氧化碳培養箱、生物安全柜和熒光檢測儀（具有 485 nm 的激發光和 520 nm 發射光的吸收檢測功能）。

1.2 方法

將細胞培養到足夠的數量并需單獨培養一盤相對濃度較低的細胞，以便做標準曲線檢測。

第 1 天：將細胞進行饑餓處理，同時用基底膜提取物包被 transwell 設備；第 2 天：將細胞平鋪在 transwell 中，并用 FBS 作為誘導劑，可以同時考慮多加一個實驗組用于繪制標準曲線；第 3 天：檢測通過基底膜的細胞數量，并繪制標準曲線。

1.2.1 細胞培養 細胞的密度應該低于 80%，這樣可以保證經過 24 h 饑餓處理的細胞也不會長得過于密集，吸去含有血清的細胞培養基，輕輕地用 PBS 清洗細胞去除殘留的血清，用不含血清的 IMDM 培養細胞，放置于培養箱中培養 24 h。

1.2.2 BME的包被 在檢測過程中，不同的細胞系所需的 BME 的最適濃度有所不同。對于特定的細胞系，建議做一個梯度檢測（比如從 0.1 × 到 1 × 稀釋）從中找出最適濃度。只有在最適的 BME 濃度下，才可以看到細胞的侵襲性和非侵襲性在趨化誘導作用下的最大差異。

⑴在無菌條件下，用無菌去離子水將 10 × 的包被儲液稀釋成 1 ×。

⑵將 5 × 的 BME 儲液放到 37 ℃水浴中，輕輕攪動瓶子使其完全融化。融化后的 BME 儲液應盡快稀釋或者放在冰上，否則其在稍高溫度下將會變得非常黏稠。

⑶用 1 × 的包被液將 5 × 的BME 稀釋到最適的濃度。

⑷用稀釋后的 BME 溶液包被 transwell（表 1）。

⑸將包被后的培養板放到 37 ℃二氧化碳培養箱中過夜。

1.2.3 平鋪細胞并繪制標準曲線 以 HTS-96 transwell 為例詳細介紹細胞侵襲性檢測的步驟，其也同樣適用于其他不同規格的 transwell。實驗過程中還需要另外再加一個陽性對照，即不經過 BME 包被的 transwell 微孔，用于計算具有侵襲性的總的細胞數。

⑴使用 HyQtase 溶液或者其他合適的細胞消化液收集細胞。

⑵使用不含血清的培養基或者胰蛋白抑制劑終止消化。

表 1 推薦的 BME 溶液包被體積

注：*Corning transwell 6.5 mm 直徑的小室（24 孔板用），每包 12 個。

⑶離心去除上清，用不含血清的培養基重懸細胞沉淀。

⑷對細胞計數并以合適的濃度將細胞稀釋于含有血清的培養基中（表 2）。

表 2 推薦的細胞接種密度和體積

⑸將微孔中多余的 BME 吸出，同時將細胞平鋪在上面。

⑹留出至少一個孔不加細胞，作為陰性對照，以扣除背景值（圖 1）。

非侵襲性 MCF-7 細胞侵襲性HT1080 細胞 123456789101112 A B C D E F G H 不含 BME 的無血清培養基 含 BME 的無血清培養基 不含 BME 的培養基+ 10% FBS 含 BME 的培養基+ 10% FBS 空白對照

⑺在加有細胞的孔中，一些用不含血清的培養基培養（即沒有趨化誘導），另外一些用含有血清的培養基培養（即含有趨化因子），具體參照圖 1。

⑻根據所使用的細胞系的不同，培養 12 ~ 24 h。

1.2.4 繪制標準曲線

⑴對于每一次的檢測和每一種細胞系都需要做出一個相應的標準曲線。

⑵將細胞消化并收集到一個 EP 管中。

⑶用超純去離子水將 10 × 細胞裂解液配制成 1 × 細胞裂解液（1 × CDS）。

⑷將 Calcein AM 鈣熒光素乙酰氧基甲酯（50 μg）融化，加入 30 μl 的 DMSO 配制成工作濃度。

⑸離心收集細胞并重懸于 1 × CDS。

⑹將細胞稀釋成一系列不同濃度的細胞懸液，從最高濃度依次到不含細胞的 1 × CDS 溶液。可以參照表 3 中推薦的細胞濃度梯度來繪制標準曲線。

表 3 96 孔板中做標準曲線所需的細胞量

⑺從每一個濃度梯度中，吸取 50 μl 到 96 孔黑板（如果使用 96 孔 HTS 平板，選擇康寧 Cat.No.3583 產品，其他的選擇康寧 Cat.No.3916，每組做 3 個重復。

⑻用 1 × CDS 稀釋 Calcein AM 鈣熒光素乙酰氧基，按照每 1 ml 1 × CDS 加入 2.4 μl Calcein AM 溶液的比例進行稀釋。

⑼在繪制標準曲線的 96 孔板上，每孔加入 50 μl 的 Calcein AM/CDS 混合液。

⑽將 96 孔板在室溫下避光孵育 1 h，然后檢測其在 485 nm 激發光下 520 nm 處的熒光強度。

⑾對于每一個濃度梯度，計算出相應的平均相對熒光強度（RFU），之后扣除背景值。

⑿繪制細胞濃度和 RFU 相關的標準曲線。

⒀添加線性趨勢線（截距設為 0）y = mx + b，y 代表細胞數；x 代表 RFU。如圖 2 所示。

細胞數6 × 1045 × 1044 × 1043 × 1042 × 1041 × 1040 2.00E 4.00E 6.00E 8.00E 1.00E + 03 + 03 + 03 + 03 + 04 平均相對熒光強度

1.2.5 檢測

⑴用超純去離子水將 10 × 細胞裂解液稀釋成 1 ×（1 × CDS）。

⑵將 Calcein AM 鈣熒光素乙酰氧基甲酯（50 μg）融化，加入 30 μl 的 DMSO 配制成工作濃度。

⑶用 1 × CDS 稀釋 Calcein AM 鈣熒光素乙酰氧基，按照每 1 ml 1 × CDS 加入 1.2 μl Calcein AM 溶液的比例進行稀釋?；旌弦簯芄獗４?。對于不同規格的 transwell，可以參照表 4 加入合適量的混合液。

表 4 推薦的 Calcein AM/1 × CDS 溶液體積

⑷從檢測板和 transwell 中吸出多余的培養基。

⑸用清洗緩沖液分別清洗 transwell 一次和檢測孔板 2 次。具體的量參照表 5。

表 5 洗脫液體積

⑹加入 Calcein AM/CDS 混合液到檢測板的微孔中。

⑺將 transwell 放到浸滿 Calcein AM/CDS 混合液的檢測板中。確保在 transwell 底部和孔板底部沒有空氣殘留。之后將整個檢測板放置于 37 ℃二氧化碳培養箱中溫育 30 min。

⑻30 min 后，輕輕敲打孔板的側面，之后放回培養箱中再次溫育 30 min。

⑼從 96 孔檢測板中移出插入托盤，并輕輕晃動以混勻細胞溶液。之后可以將檢測板直接放入檢測儀上進行熒光強度的檢測。

1.3 數據分析

1.3.1 收集數據。參見表 6a。

1.3.2 除背景值。背景即為沒有包被和細胞的對照組。參見表 6b。

1.3.3 根據標準曲線的公式將RLU 的值轉換成細胞數量。參照表 6c。

1.3.4 根據表 6c 中的細胞數量計算出通過基底膜的總的細胞數，然后乘以表 4 中的倍增系數，得出每孔侵襲細胞的百分比（表 6d）。

表 6a HT1080 細胞采用 96 孔 HTS transwell 板在讀板機上讀取的原始 RFU 數據示例（MCF-7 的數據未列出）

No BME,No FBSNo BME +10% FBSWith BME,No FBSWith BME +10% FBS 196 218 205195 216 208 45434885188569269374300639152845051 37334184517347289422273840181286830 394 6776 255292258652244595635 418371586715962793863 429438293687675776199 297 4941

表 6b 扣除背景之后的數據范例

No BME,No FBSNo BME +10% FBSWith BME,No FBSWith BME +10% FBS 0 0 0 0200*00 212* 25815283008351 69174100619750274839 17714582337128 8922273818979166618 198 6558 55 9258631042475426 218171386694760676651 22923893666473645987 97 4747 *: Average of multiple blank wells from table 6a, use for backgroundsubtract of test wells.

表 6c 根據標準曲線計算的每孔細胞量

No BME,No FBSNo BME +10% FBSWith BME,No FBSWith BME +10% FBS Solve for cell number (from figure 2): y = 5.9673x + 1236.5 277621445076551069164822751833382163123430112 229321025036543771176825611672501034847440728 2418 40370 156517851583388902658033615 253722573540426913744040925 260326571791410034518036963 1815 29563

表 6d 每孔侵襲細胞百分比

No BME,No FBSNo BME +10% FBSWith BME,No FBSWith BME +10% FBS Calculate % invasion = (cell concentration / initial cell seed)× multiplication factor (Table 4) 5.6%4.3%101.5%102.1%3.3%4.5%3.7%76.4%62.5%60.2% 4.6%4.2%100.7% 87.5%3.5%5.1%3.3%100.2%96.9%81.5% 4.8% 3.1%3.6%3.2%77.8%53.2%67.2% 5.1%4.5%7.1%85.4%74.9%81.9% 5.2%5.3%3.6%82.0%90.4%73.9% 3.6% 59.1%

1.3.5 通過基底膜的細胞數除以起始細胞數可以得到所有孔在相應條件下的侵襲細胞百分比，從而得出結果（表 6e 和圖 3）。

表 6e 細胞侵襲和趨化性的平均百分比

No BME1 × BME 4.7% 4.4%–FBS 94.2%74.3%+FBS STD % invasion HT1080 No BME1 × BME 0.5% 1.2%–FBS 9.8%13.8%+FBS

2 討論

⑴對于非侵襲性細胞系，無論是否有趨化因子的誘導，都應該沒有或者幾乎沒有細胞的遷移或者運動。

⑵在不含血清的培養基中生長的侵襲性細胞的遷移率應該低于 10%。

圖 3 根據表 6e 數據做的柱狀圖

（包含 MCF-7 的數據）

⑶當使用 FBS 進行趨化誘導時，細胞在 BME 包被和非包被的情況下，其遷移率的差異性應該≥ 20%。

2014-09-01

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.05.015