益髓生血顆粒特定指紋圖譜及特征峰分析

孫玉雯，劉起華，文 謹，吳志奎

(中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053)

中藥是典型的復雜體系，具有多組分與多靶點的特點，在目前對其臨床療效了解較多而作用機制尚未完全明了的情況下，僅以某一指標性成分的定性或定量來評價中藥的質量是不全面的［1］。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的質量控制手段，其基本屬性是整體性和模糊性［2-4］，這與中醫理論的整體性原則和中藥作用機制的模糊性是相對應的，因此指紋圖譜已成為國際公認的控制中藥和天然藥物質量的最有效手段［5-6］。

益髓生血顆粒具有滋陰補腎、益髓生血、補氣健脾之功效，是吳志奎教授根據中醫腎生髓、髓生血理論，以補腎益髓法創制的具有我國自主知識產權的、唯一用于治療地中海貧血的中藥制劑。本課題組依托多項國家課題和基金的資助，在我國廣西南寧地中海貧血高發區開展臨床研究近30年，取得肯定的可重復的臨床療效［7-10］。該藥由山茱萸、何首烏等11味中藥組成，成分復雜，目前對該藥的質量評價方法僅有薄層色譜法，標準亟待提高。為確保該品種的質量穩定、可控，本研究建立了益髓生血顆粒的UPLC指紋圖譜，并對其共有峰進行了定性鑒別和藥材歸屬分析，以實現多成分評價益髓生血顆粒質量的方法，為探索其治療地中海貧血的藥效物質基礎提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters Acquity H-Class UPLC超高效液相色譜儀(四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器以及Empower 2工作站)、Acquity UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7μm)(美國Waters公司);電子分析天平(德國Sartorius公司)。

1.2 試劑 甲醇、磷酸(均為分析純，北京化學試劑公司);乙腈(色譜純，Fisher Chemical公司，4 L);屈臣氏蒸餾水。

1.3 樣品 實驗用的益髓生血顆粒系中國中醫科學院廣安門醫院制劑中心生產提供(批號為110124、 110506、 110519、 110602、 110612、110801、111012、111207、120405、120516，編號為S1～S10)深褐色顆粒，每1 g藥粉相當于2.36 g生藥。

1.4 對照品及藥材

1.4.1 對照品 馬錢苷(批號111640-200604)、二苯乙烯苷(批號 110844-200607)、補骨脂素(批號 110739-200613)、異補骨脂素(批號110738-201012)、芒丙花素(批號111703-200501)、大黃素(批號110756-200110)、槲皮素(批號 100081-200406)、大黃素甲醚(批號110758-200610)、沒食子酸(批號110831-200302)均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.4.2 藥材 山茱萸、制何首烏、熟地黃、炙黃芪、黨參、當歸、補骨脂、雞血藤、阿膠、鱉甲、砂仁均購自本草藥材公司，經藥劑科劉起華老師鑒定均為《中國藥典》各項下規定的藥材品種。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備 取益髓生血顆粒1 g，碾碎，精密稱量，置100 mL具塞錐形瓶中，精確加入30 mL甲醇，密塞，稱定質量，超聲提取30 min，取出冷至室溫，擦凈瓶外壁，稱定質量，用提取溶劑補足失質量，搖勻，濾過，濾液過微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備 取對照品，精密稱定，加甲醇制成對照品溶液，再精密吸取沒食子酸(0.226mg/mL)0.25mL、馬 錢 苷(0.226 mg/mL)0.8 mL、二苯乙烯苷(0.202 mg/mL)0.5 mL、槲皮素(0.182 mg/mL)0.1 mL、補骨脂素(0.13 mg/mL)0.5 mL、異補骨脂素(0.176 mg/mL)0.5 mL、芒柄花素(0.083 mg/mL)0.1 mL、大黃素(0.159 mg/mL)0.1 mL、大黃素甲醚(0.196 mg/mL)0.2 mL于10 mL的量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過，濾液作為混合對照品溶液。

2.3 對照藥材溶液的制備 取方中山茱萸、制何首烏、熟地黃、炙黃芪、黨參、當歸、補骨脂、雞血藤、阿膠、鱉甲、砂仁藥材，按益髓生血顆粒的提取工藝提取各藥材，減壓干燥，并按組方比例及各藥材得膏率稱取各藥材干膏，按樣品溶液的制備方法制備各對照藥材的供試液。

2.4 色譜條件 柱溫30℃;體積流量0.25 mL/min;進樣量 3μL;流動相為乙腈(A)-0.1% 磷酸水溶液(B)梯度洗脫，0～8 min(3%～15%A)，8～18 min(15% ～45%A)，18～20 min(45% ～70%A)，20～22 min(70% ～100%A)，22～23 min(100% ～3%A)。

2.5 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液(批號110801)，連續重復進樣6次，按“2.4”項下色譜條件進行檢測，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A版)對6次測定結果進行計算，其相似度均為0.99以上。以12號峰(補骨脂素)為對照峰S，考察6次測定的色譜中各共有峰的相對保留時間及相對ln(峰面積)比值的一致性，結果顯示兩者的RSD值均小于3%，整個檢測系統的精密度良好，符合指紋圖譜的要求。

2.6 穩定性試驗 取同一供試品溶液(批號110801)，分別在0、2、4、8、12、24 h按 “2.4”項下條件進行檢測，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A版)對6次測定結果進行計算，其相似度均為0.99以上。以12號峰(補骨脂素)為對照峰S，考察6次測定的色譜中各共有峰的相對保留時間及相對ln(峰面積)比值的一致性。各共有峰的相對保留時間及相對ln(峰面積)的RSD值均小于3%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.7 重復性試驗 取益髓生血顆粒(批號110801)共6份，分別按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下條件進行檢測，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A版)對6次測定結果進行計算，其相似度均為0.99以上。以12號峰(補骨脂素)為對照峰S，考察6次測定的色譜中各共有峰的相對保留時間及相對ln(峰面積)比值的一致性。各共有峰的相對保留時間及相對ln(峰面積)的RSD值均小于3%，表明本方法的重復性良好。

2.8 指紋圖譜的建立 取10批益髓生血顆粒，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，并按“2.4”項下條件進行檢測，記錄色譜圖，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A版)對10批供試品的色譜圖進行比較分析，選擇吸收信號較強、穩定性好、重復性好、峰形明顯的16個色譜峰標定為共有峰(圖1)。

圖1 10批益髓生血顆粒樣品UPLC色譜圖Fig.1 UPLC characteristic chromatograms of ten batches of samples

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A版)，將10批樣品數據導入該軟件，對選定的16個特征峰進行多點校正，自動匹配，得到益髓生血顆粒對照指紋圖譜，各批益髓生血顆粒樣品的UPLC圖譜與對照指紋圖譜比較，并計算其相似度，結果表明益髓生血顆粒樣品整體相似度為0.800～1.000，不同批號之間的成分基本一致(表1)。

表1 10批益髓生血顆粒樣品相似度評價結果Tab.1 Results of similarities evaluation for ten batches of Yisui Shengxue Granules

選擇色譜峰穩定、重復性好的12號峰(補骨脂素)為對照峰S，對其特征峰的保留時間和相對ln(峰面積)進行比較統計分析。從結果看，各共有峰的保留時間RSD值為0～0.34%，小于1%，不同批次的藥品同一位置特征峰的保留時間較為穩定，16個特征峰都能穩定出現。但其相對ln(峰面積)的RSD值高達70%以上，這一結果說明，各批樣品的16個特征峰所對應的成分量相差較大，這一結果進一步解釋上述與對照圖譜比較，相似度偏低的原因，造成這一現象的原因可能是該制劑前期的質量標準僅有薄層鑒別，導致原藥材質量控制不夠嚴格，提示我們應注重提高該藥質量控制的監管手段，盡量保證藥品的質量穩定。

2.9 益髓生血顆粒樣品中共有峰的歸屬分析

2.9.1 對照品對照分析 取益髓生血顆粒樣品以及“2.2”項下的混合對照品溶液，按“2.4.3”項下色譜條件進行檢測，通過保留時間與UV光譜的對照分析，確定了各峰的歸屬，具體見圖2。

圖2 益髓生血顆粒指紋圖譜與各對照品的色譜比較圖Fig.2 Comparison of UPLC characteristic chromatograms of Yisui Shengxue Granules and compound standard

2.9.2 益髓生血顆粒樣品中共有峰的藥材歸屬分析 取益髓生血顆粒及“2.3”項下組方藥材的供試品溶液，按“2.4.3”項下色譜條件進行檢測，以保留時間和UV光譜確認各共有峰的來源(圖3)。可以看出，其中1～5、8號峰來自山茱萸，1、3、7、9、15、16號峰來自何首烏，來自君藥的色譜峰共10個，占總色譜峰的62.5%;2、3號峰來自熟地黃，6、7、12、13號峰來自補骨脂，8、10、11、14號峰來自黃芪，2號峰來自黨參，2、8號峰來自當歸，來自臣藥的色譜峰共10個，占總色譜峰的62.5%，10、14號峰來自雞血藤，來自佐藥的色譜峰共2個，占總色譜峰的12.5%。在當前的色譜條件下，阿膠、鱉甲樣品中無相應色譜峰被檢出，砂仁沒有色譜峰顯示在共有模式中。

圖3 益髓生血顆粒與單味藥材UPLC色譜圖比較Fig.3 Comparison of UPLC characteristic chromatograms of Yisui Shengxue Granules and single Chinese medicine

3 討論

地中海貧血是世界范圍內發病率高、危害大的單基因遺傳病，西方醫學尚無確切有效的治療方法［11］。益髓生血顆粒是目前唯一用于治療該病的中藥制劑，本課題組多年的療效機制研究顯示，該藥通過修飾、調節基因表達和基因產物功能，獲得無副作用和后遺癥的顯著療效［12-15］。為了更好地控制益髓生血顆粒質量，探討其藥效物質基礎，本實驗開展了該藥指紋圖譜的研究。研究初期，曾用普通的高效液相色譜儀檢測，分析樣品用時達80 min，本實驗所采用的UPLC方法，靈敏度高，同樣的梯度洗脫系統，其用時僅為普通液相色譜的四分之一，且該色譜方法性能穩定，具有可重復性。

在確定的色譜條件下，比較10批樣品的色譜圖，建立了益髓生血顆粒甲醇提取物的UPLC指紋圖譜，標定了16個共有峰，通過對照品比對，確定其中9個色譜峰分別為沒食子酸、馬錢苷、二苯乙烯苷、槲皮素、補骨脂素、異補骨脂素、芒柄花素、大黃素、大黃素甲醚。通過與各單味藥材樣品色譜圖的比較，基本確定16個共有峰的藥材歸屬為:來自君藥山茱萸和何首烏共10個，占總色譜峰的62.5%;來自臣藥熟地黃、黃芪、黨參、當歸、補骨脂共10個峰，占總色譜峰的62.5%，來自佐藥的色譜峰共2個，占總色譜峰的12.5%。

10批益髓生血顆粒色譜峰中16個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的計算比較顯示，不同批號之間的成分基本一致，各共有峰的出峰時間穩定，但各批樣品中共有峰所對應的化合物的量波動較大。這可能是因為原藥材的產地、炮制加工的差別所致，提示應當提高原藥材檢查的力度，盡量固定藥材來源，優化生產工藝，保證藥品的質量穩定。

本實驗結果使益髓生血顆粒中尚不明確的各個成分由無序到有序，各個色譜峰的歸屬明確，來源清晰，并確定其中9種成分，對于已知成分可進行定量測定，通過未知成分的相對保留時間與相對峰面積等參數，可以較為客觀地評價益髓生血顆粒的內在質量，同時也為進一步開展其該藥進入體內成分研究、藥效物質基礎的確定以及配伍規律的解析等奠定了基礎。

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