新疆不同產地紅花質量評價

劉雅新，劉珊珊，譚 勇，陳 文

(新疆特種植物藥資源教育部重點實驗室，新疆石河子 832002)

紅花為菊科植物紅花Carthamus tinctorius L.的干燥管狀花，味辛性溫，歸心、肝經，具有活血通經、散瘀止痛的功效［1］。紅花化學成分復雜，主要含有查爾酮類色素、黃酮類、酚酸類、甾體類及多糖類等化合物［2-5］。由于紅花獨特的藥理作用［6-8］，目前國內外對紅花的需求量日益增加，而新疆紅花的種植面積和產量占全國的80%［9］，因此控制新疆紅花藥材的內在質量［10］以及發展新疆紅花道地藥材的生產已成為當務之急，而有關新疆不同產地紅花質量評價的文獻目前還沒有報道。本實驗對新疆32批不同產地的紅花質量進行了系統的分析與評價，采用《中國藥典》“紅花”項下有效成分檢測指標為標準，測定并比較新疆不同產地紅花中羥基紅花黃色素A與山柰素的量，同時對10批新疆不同產地紅花進行了HPLC指紋圖譜的對比研究，旨在為評價新疆不同產地紅花的質量提供科學依據，為篩選出優良的紅花產地和實施GAP奠定重要基礎。

1 儀器與材料

LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司);Sartorius BP211D十萬分之一分析天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司);Sartorius分析天平(北京賽多利斯天平有限公司);CF-16RX高速離心機(日本日立科學儀器有限公司)。

羥基紅花黃色素A對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號111637-200503);山柰素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110861-200606);紅花樣品(產地新疆);甲醇、乙腈為色譜純;磷酸為分析純;蒸餾水與雙蒸水(實驗室自制)。

2 方法與結果

2.1 羥基紅花黃色素A的測定［1］

2.1.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm);流動相為甲醇-乙腈-0.7%磷酸水溶液(26∶2∶72);檢測波長403 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃;進樣量20μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 取羥基紅花黃色素A對照品適量，精密稱定，加25%甲醇制成0.51 mg/mL的溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取紅花粉末(過三號篩)0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)40 min，放冷，再稱定質量，用25%甲醇補足減失的質量，過濾，取續濾液，即得。

2.1.4 樣品測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，按上述方法進行測定，色譜圖見圖1，羥基紅花黃色素A測定結果見表1。

圖1 羥基紅花黃色素A(A)對照品和紅花樣品(B)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of hydroxysafllor yellow A(A)and safflower sample(B)

表1 新疆不同產地紅花中羥基紅花黃色素A和山柰素Tab.1 Hydroxysafllor yellow A and kaempferide content in safflower from different habitats in Xinjiang

2.2 山柰素的測定［1］

2.2.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm);流動相為甲醇-0.4%磷酸水溶液(52∶48);檢測波長367 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃;進樣量20μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 取山柰素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成0.08 mg/mL的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取紅花粉末0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入甲醇25 mL，稱定質量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失質量，濾過，取續濾液15 mL，置平底燒杯中，加鹽酸溶液(15→37)5 mL，搖勻，置水浴中加熱水解30 min，立即冷卻，轉移至25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 樣品測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，按上述方法進行測定，色譜圖見圖2，山奈素測定結果見表1。

2.3 新疆不同產地紅花HPLC指紋圖譜的建立［11-15］及對比研究

2.3.1 色譜條件 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm);流動相為乙腈(A)-0.5%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0 min，5%A;55 min，25%A;65 min，5%A);檢測波長275 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃;進樣量20μL。

圖2 山柰素對照品(A)和紅花樣品(B)的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of kaempferide(A)and safflower sample(B)

2.3.2 對照品溶液制備 取羥基紅花黃色素A對照品適量，精密稱定，加水制成2.50 mg/mL的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液制備 取紅花粉末(過三號篩)0.4 g，加入水50 mL，稱定質量，超聲處理(功率250 W頻率59 kHz)60 min，放冷再稱定，補足減失質量，濾過，取續濾液，即得。

2.3.4 精密度試驗 取同一份紅花樣品的供試品溶液連續進樣5次，按“2.3.1”項色譜條件檢測指紋圖譜。以羥基紅花黃色素A為參比峰，考察各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性，結果表明，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均在3%以下，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜的檢測要求。

2.3.5 重復性試驗 取同一批紅花樣品5份，按供試品溶液的制備方法分別制備供試品溶液，按“2.3.1”項色譜條件檢測，以羥基紅花黃色素A為參比峰，計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果表明，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積值的RSD均在3%以下，表明該方法具有較好的重復性。

2.3.6 穩定性試驗 取同一份紅花樣品作為供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h檢測指紋圖譜，以羥基紅花黃色素A為參比峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果表明，共有峰的相對保留時間和相對峰面積值的RSD均在3%以下，表明樣品溶液在24 h內穩定，符合指紋圖譜檢測要求。

2.3.7 新疆不同產地紅花指紋圖譜的建立 在同一個色譜條件下，對收集的10批新疆不同產地紅花進行測定，比較各樣品的HPLC指紋圖譜(圖3)，得20個共有特征峰(圖4)，因此確定這20個峰為共有指紋峰。

圖3 10批新疆不同產地紅花HPLC指紋圖譜Fig.3 Fingerprint graphics of 10 batches safflower samples from different habitats in Xinjiang

圖4 新疆紅花指紋圖譜特征峰Fig.4 Fingerprint characteristic peak of safflower sample from different habitats in Xinjiang

2.3.8 新疆不同產地紅花指紋圖譜相似度評價由32批新疆不同產地紅花中羥基紅花黃色素A與山柰素的測定結果可知，塔城、伊犁、昌吉、和田與喀什地區內羥基紅花黃色素A與山柰素的量相差不大，但不同地區之間有明顯差異，因此分別選擇2批塔城、伊犁、昌吉、和田與喀什地區的紅花樣品，測定10批新疆不同產地的紅花藥材，記錄指紋圖譜，并采用“計算機輔助相似度評價系統”軟件(2004A)進行數據處理，10批新疆不同產地紅花藥材的相似度均在0.95以上(見表2)。

2.3.9 樣品主成分聚類分析 本實驗采用已建立的紅花藥材指紋圖譜色譜條件，對10批新疆不同產地的紅花藥材進行了指紋圖譜聚類判別分析，將各色譜峰相對峰面積與樣品號建立矩陣，應用SPSS 19.0軟件，采用組間均聯法，以歐氏距離為測度，得到紅花藥材的聚類譜系圖(圖5)。由聚類分析結果圖可以看出，10批新疆不同產地紅花共聚為四個大類。其中北疆昌吉地區木壘縣東城鎮與北疆昌吉地區奇臺縣半截溝鎮為一類，南疆和田洛浦縣山普魯鄉與南疆和田策勒縣策勤鄉為第二類，南疆喀什葉城縣鐵提鄉與南疆喀什英吉沙縣城關鄉為第三類，北疆塔城地區164團、北疆塔城地區多拉特鄉、北疆伊犁地區果子溝與北疆伊犁地區察縣四鄉為第四類。

表2 10批新疆不同產地紅花指紋圖譜間的相似度Tab.2 Similarity analysis of 10 batches safflower samples from different habitats in Xinjiang

圖5 10批新疆不同產地紅花聚類分析結果圖Fig.5 Hierarchical clustering result of 10 batches safflower samples from different habitats in Xinjiang

3 討論

3.1 由32批產自新疆不同地區的紅花樣品中羥基紅花黃色素A的測定結果可知，大部分產地紅花樣品中羥基紅花黃色素A的量高于藥典標準，昌吉地區紅花樣品的羥基紅花黃色素A量最高，和田地區紅花樣品的羥基紅花黃色素A量最低，其中和田策勤縣紅花樣品的羥基紅花黃色素A量僅為0.93%，低于國家藥典標準，北疆地區紅花樣品的羥基紅花黃色素A量高于南疆地區紅花樣品。因此，在選擇紅花的種植區域時，因考慮種植地區對紅花有效成分的影響，由此可知，昌吉地區可作為紅花的最佳種植區域。

3.2 由32批產自新疆不同地區的紅花中山柰素的測定結果可知，昌吉地區紅花樣品山柰素的量最高，和田地區紅花樣品的山柰素量最低，低于國家藥典標準，北疆產地紅花樣品中山柰素量高于南疆產地樣品。由以上結果可知，昌吉地區可作為種植紅花的最佳區域。

3.3 根據10批不同產地紅花樣品指紋圖譜的相似度評價結果可知，本實驗收集的新疆不同產地紅花主要峰群整體圖貌基本一致，共有峰相對保留時間基本一致，所含的主成分基本相似，而不同產地紅花的相對峰面積差異較大，其中昌吉地區的相對峰面積最大，和田地區的相對峰面積最小，說明不同產地的環境、氣候等因素對紅花藥材中各種成分的量有較大影響。

［1］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］．北京:中國醫藥科技出版社，2010:157．

［2］王若菁，楊 濱．紅花的化學成分及質量標準研究進展［J］．中國實驗方劑學雜志，2007，13(5):65-69．

［3］劉玉明，楊峻山，劉慶華．紅花化學成分研究［J］．中藥材，2005，28(4):288-289．

［4］李艷梅，車慶民．紅花化學成分的研究［J］．藥學學報，1998，33(8):626-628．

［5］尹宏斌，何直升，葉 陽．紅花化學成分的研究［J］．中草藥，2001，32(9):776-778．

［6］戎惠珍．紅花的化學成分及藥理研究概況［J］．江西中醫學院學報，1997，9(4):45．

［7］吳 偉，金 鳴，楊樹東，等．紅花總黃素抑制血小板激活因子所致毛細血管通透性增加的研究［J］．心肺血管病雜志，1999，18(4):281．

［8］陳 夢，趙丕文，孫艷玲，等．紅花及其主要成分的藥理作用研究進展［J］．環球中醫藥，2012，5(7):556-560．

［9］楊 輝，阿依吐倫·斯馬義．羥基紅花黃色素A的提取及含量測定［J］．新疆醫科大學學報，2008，31(10):1358-1360．

［10］Guidance for industry．Botanical drug products［M］．Draft Guidance:CDER/FDA，2000．

［11］宋金春，胡傳芹，曾俊芬，等．紅花的HPLC指紋圖譜研究［J］．中國藥學雜志，2005，40(18):1378-1380．

［12］謝國祥，邱明豐，張漢杰，等．利用高效液相色譜建立紅花的色譜指紋圖譜［J］．中成藥，2007，29(8):1093-1097．

［13］國家藥品監督管理局．中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)［S］．2000:3-7．

［14］周曉英，張立新，張 良，等．紅花的指紋圖譜分析方法研究［J］．中成藥，2002，24(5):325-327．

［15］胡 燕，王文波，宋力飛，等．紅花HPLC指紋圖譜研究［J］．湖南中醫雜志，2013，29(3):110-112．