珍珠母炮制前后寡肽類化合物的結構鑒定及對比分析△

張輝，劉東，李影，趙好冬，李梅，孫佳明

(長春中醫藥大學 中醫藥與生物工程研發中心，吉林 長春 130117)

研究開發

國家自然基金——基于肽鏈熱振蕩理論對熱炮制珍珠母物質基礎與生物活性變化機理研究(81073048)

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孫佳明，副研究員，碩士生導師，研究方向：中藥藥效物質基礎；E-mail:sun_jiaming2000@163.com

珍珠母炮制前后寡肽類化合物的結構鑒定及對比分析△

張輝，劉東，李影，趙好冬，李梅，孫佳明*

(長春中醫藥大學 中醫藥與生物工程研發中心，吉林 長春 130117)

目的對中藥珍珠母炮制前后寡肽類化合物結構進行鑒定及對比分析。方法采用高效液相色譜-電噴霧串聯質譜(HPLC-DAD-ESI-MS/MS)技術對珍珠母炮制前后的寡肽類化合物進行結構分析。結果初步解析了珍珠母生品中4個寡肽化合物的結構，分別為Op-1(COOH-Lys-Ala-NH2)、Op-2(COOH-Asn-Val-NH2)、Op-3(COOH-Asn-Val-Ala-NH2)和Op-4(COOH-Asn-Val-Ala-Ala-NH2)；而炮制品中不含Op-1，含有其他3個寡肽Op-2、Op-3和Op-4。結論本方法可用于珍珠母藥材中寡肽類化學成分的快速分析及結構鑒定，并對珍珠母炮制前后的藥效物質變化規律及炮制機理研究提供了科學依據。

珍珠母；寡肽；炮制；高效液相色譜；電噴霧質譜

珍珠母為蚌科動物三角帆蚌Hyriopsiscumingii(Lea)、褶紋冠蚌Cristariaplicata(Leach)或珍珠貝科動物馬氏珍珠貝Pteriamartensii(Dunker)的貝殼，為我國傳統中藥,收載于歷版《中國藥典》，具有平肝潛陽，安神定驚，明目退翳的作用，用于頭痛眩暈，驚悸失眠，目赤翳障，視物昏花[1]。其主產于江蘇、浙江、河北、安徽等地，多數集中在江蘇蘇州，加工制成紐扣，剩余殘料銷往全國各地，作珍珠母入藥。近年來，國內外學者對珍珠母中的化學成分進行了大量研究，表明珍珠母中含有碳酸鈣、硬蛋白、氨基酸、微量元素等多種化合物，并發現它們具有抗氧化、利尿、抑制腸管和子宮收縮等作用。目前，關于珍珠母的文獻報道主要集中在對珍珠母的氨基酸、微量元素等含量測定[2-4]和抗氧化活性研究[5]上，而應用液相色譜-質譜聯用技術對珍珠母中寡肽類化合物的結構鑒定，尤其是對珍珠母炮制前后寡肽類化合物的對比分析尚未見報道。近年來，高效液相色譜-質譜聯用技術在中藥的快速分析分離及結構鑒定方面顯示出越來越重要的作用[6-7]。本文對珍珠母及其炮制品中寡肽類化合物一級結構進行了對比分析研究。

1 材料與儀器

1.1 材料

珍珠母采于吉林省嫩江畔月亮湖，經長春中醫藥大學張輝教授鑒定為蚌科動物三角帆蚌Hyriopsiscumingii(Lea)的貝殼。

1.2 儀器

BS110S電子天平(德國賽多利斯股份公司)；FD-1000凍干機(東京理化株式會社)；電熱恒溫水浴鍋(北京國華醫療器械廠)；SHZ-Ⅲ型循環水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)；CR20B2 型冷凍高速離心機(日本日立)；閃式蒸發濃縮系統(長春康彼達科技有限公司)；Agilent 1100HPLC，Agilent 6350 ESI-MS/MS(美國Agilent公司)。

2 方法

2.1 樣品的制備

珍珠母生品：將晾干的珍珠母粉碎過40～60目篩。

珍珠母炮制品：將珍珠母生品于150 ℃烘箱中烘烤1 h，取出，晾涼即得。

珍珠母生品總寡肽：取珍珠母生品1 kg，加蒸餾水3 L，加熱回流提取2次，每次2 h，濾過，合并濾液，閃蒸濃縮后，凍干，取珍珠母生品凍干粉粉末5 mg，加水1 mL溶解，過0.45 μm膜，供液質聯用分析。

珍珠母炮制品總寡肽：依珍珠母生品總寡肽的制備方法制得。

2.2 色譜條件

Venusil ASB-C18色譜柱(150 A，250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為1‰甲酸乙腈(A)，1‰甲酸水溶液(B)，進樣量為10 μL，流速為0.3 mL·min-1，柱溫為30 ℃，洗脫時間為20 min，按A-B(1∶99)等度洗脫。

2.3 質譜條件

電離源：電噴霧離子源(ESI)，檢測方式：正離子檢測，掃描范圍：m/z 50～1 200，干燥氣溫度：350 ℃，干燥氣流量：11.0 L·min-1，霧化氣壓強：45.0 psi，毛細管電壓：4 kV。

3 結果

取珍珠母生品和炮制品總寡肽按上述色譜條件和質譜條件應用液質聯用儀分析，得到二者的總離子流圖及各肽的一級、二級質譜圖。對珍珠母生品和炮制品總寡肽總離子流圖的色譜峰進行對比分析，發現其生品和炮制品中都有準分子離子為m/z 232、303和374的寡肽類化合物，但炮制品中一個準分子離子為218的二肽消失，以上4個寡肽類化合物依照出峰時間命名為Op-1、Op-2、Op-3和Op-4，二者總離子流圖如圖1所示。

A.生品 B.炮制品1.Op-1 2.Op-2 3.Op-3 4.Op-4圖1 珍珠母生品和炮制品總寡肽的總離子流圖

電噴霧質譜是一種軟電離技術，在正離子模式下，經常同時出現[M+H]+、[M+Na]+、[2M+H]+、[2M+Na]+等一系列準分子離子峰，但寡肽類成分的準分子離子峰一般為[M+H]+[8]。根據珍珠母生品和炮制品總寡肽準離子峰可以確定各化合物的分子量信息，通過碰撞誘導解離(CID)使目標化合物碎裂成碎片離子，從而可進一步獲得各寡肽的一級結構信息。例如生品和炮制品總寡肽中共有的Op-2準分子離子峰[M+H]+m/z為232，說明其分子量為231，氨基酸的平均分子量為128，根據氮律分子應含偶數個氮，推斷峰2可能為二肽化合物；在碰撞誘導解離過程中，m/z 232離子失去一分子水(18Da)生成m/z 214離子；m/z 232離子失去一分子纈氨酸(117Da)生成m/z 115離子；m/z 115為天冬酰胺脫去水加氫而生成的離子。結合寡肽類裂解規律，推知Op-2由纈氨酸和天冬酰胺兩個氨基酸脫水形成酰胺鍵后生成的二肽，其一級結構為COOH-Asn-Val-NH2。珍珠母生品和炮制品總寡肽的HPLC-DAD-ESI-MS/MS分析結果見表1。

表1 珍珠母生品和炮制品總寡肽正離子掃描模式的HPLC-DAD-ESI-MS/MS分析結果

注：+表示含有寡肽化合物，—表示不含有寡肽化合物。

4 討論

通過對珍珠母生品總離子流圖的分析，結合寡肽化合物的裂解規律，對珍珠母生品中的寡肽化合物進行分析及結構鑒定，推斷出Op-1、Op-2、Op-3和Op-4的一級結構，說明珍珠母中含有寡肽化合物。通過生品與炮制品的總離子流圖的對比分析，發現珍珠母經過炮制后仍然含有寡肽化合物，二者都含有分子量為231、302和373的寡肽化合物，而炮制品中一個分子量為217的二肽消失，可能是在炮制時因溫度過高而使肽鍵斷裂，二肽消失。從傳統炮制經驗可知，珍珠母經炮制后易于煎煮并提高療效，這可能與現代熱振蕩理論中蛋白、肽類成分中肽鍵經熱振蕩發生結構的變化，導致了活性發生相應的改變有關，這為探討傳統中藥炮制理論提供了科學的證據。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：216.

[2] 鐵步榮,云秦川.中藥珍珠母中碳酸鈣的含量測定[J].中國海洋藥物，1991，(2)：28-30.

[3] 李桂萍.不同品種珍珠母中氨基酸的含量測定[J].北京中醫藥大學學報，1994，17(1)：60-62.

[4] 李軒貞,成立華.珍珠母中微量元素的研究[J].中國海洋藥物，1990，(3)：5-7.

[5] 龍盛京，岑立燁，覃愛娟，等.馬氏珍珠母貝提取液抗氧自由基作用的研究[J].中國生化藥物雜志，1999，20(1)：41-43.

[6] 劉榮霞，果德安，葉敏，等.液質聯用技術(LC/MS)在中藥現代研究中的應用[J].世界科學技術—中醫藥現代化，2005，7(5)：33-40.

[7] Cai ZW，Lee FSC，Wang XR.A capsule review of recent studies on the application of mass spectrometry in the analysis of Chinese medicinal herds[J].Journal of Mass Spectrometry，2002，37：1013-1024.

[8] 王賢純，陳平，梁宋平.液相色譜-串聯質譜分析化學合成多肽及其主要副產物[J].中國生物化學與分子生物學學報，2003，19(5)：576-581.

AnalysisofOligopeptidesinMargaritiferaconchaandProcessedMargaritiferaconchabyHPLC-DAD-ESI-MS/MS

ZHANGHui,LIUDong,LIYing,ZHAOHaodong,LIMei,SUNJiaming*

(DevelopmentCenterofTraditionalChineseMedicineandBioengineering,ChangchunUniversityofTraditionalChineseMedicine,Changchun130117,China)

Objective：Comparison of the structures of oligopeptides inMargaritiferaconchaand processedMargaritiferaconcha.MethodsAnalysis of oligopeptides inMargaritiferaconchaand processedMargaritiferaconchaby HPLC-DAD-ESI-MS/MS.ResultsFour oligopeptides fromMargaritiferaconchawere identified,which are Op-1(COOH-Lys-Ala-NH2)、Op-2(COOH-Asn-Val-NH2)、Op-3(COOH-Asn-Val-Ala-NH2)and Op-4(COOH-Asn-Val-Ala-Ala-NH2)respectively.There were Op-2,Op-3 and Op-4 in processedMargaritiferaconcha.,except Op-1.ConclusionThe method could be used to analyze the structures of oligopeptides inMargaritiferaconchaand processedMargaritiferaconchaquickly.Furthermore,it provides a scientific basis for these active components change rules and the process mechanism ofMargaritiferaconchain preparation process.

Margaritiferaconcha;Oligopeptide;Preparation;HPLC;ESI-MS

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.04.005

2013-11-23)