黨參ISSR-PCR反應體系的建立與優化△

張延紅，高素芳

(甘肅中醫學院 藥學系，甘肅 蘭州 730000)

黨參ISSR-PCR反應體系的建立與優化△

張延紅*，高素芳

(甘肅中醫學院 藥學系，甘肅 蘭州 730000)

目的建立黨參的ISSR-PCR反應體系，為今后利用ISSR標記技術進行黨參鑒定及種質遺傳多樣性分析提供一個標準化程序。方法采用試劑盒法提取黨參基因組DNA為模板，通過單因素實驗分析了ISSR-PCR反應體系中MgCl2、dNTPs、引物濃度、TaqDNA聚合酶、模板DNA用量及退火溫度對ISSR-PCR擴增的影響。結果建立了重復性好，分辨率高的ISSR-PCR反應體系，即在25μL反應體系中，含有10×PCR Buffer緩沖液2.5 μL，MgCl22.0 mmol·L-1，dNTPs 0.5 mmol·L-1，引物0.4 μmol·L-1，Taq DNA聚合酶1.0 U，模板DNA為30 ng；擴增程序為：94 ℃預變性5 min，然后94 ℃變性30 s，51.7 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共計35個循環，循環結束后在72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。結論建立了適用于黨參的ISSR-PCR反應體系，為應用ISSR技術鑒定黨參種質資源、分子標記輔助選擇育種及其遺傳多樣性研究奠定了基礎。

黨參；ISSR-PCR；反應體系；優化

黨參為桔?？浦参稂h參CodonopsisPilosula(Franch.)Nannnf.的干燥根，為我國大宗、常用藥材，也是甘肅道地藥材之一，是中國常用的傳統補益用藥，具有補中益氣、健脾益肺之功效，廣泛用于脾肺虛弱、氣短心悸、食少便溏、虛弱咳嗽等癥[1]。近年來野生黨參資源已十分稀少，個體間的距離也較遠[2]，因此，建立黨參ISSR-PCR反應體系，進一步研究該物種的遺傳多樣性是一項十分必要的工作。

ISSR分子標記因具有操作簡單、快速高效、遺傳多態性高、重復性好等特點，近年來已廣泛應用于植物品種鑒定，種質資源和遺傳多樣性的研究等方面。ISSR-PCR體系的專屬性比較強，不同種植物，其反應體系有一定的差異，只有在最佳的條件下，才能獲得穩定清晰的多態性條帶[3-4]。本試驗探討了影響ISSR-PCR反應的多個因素，建立了黨參ISSR-PCR反應體系，為進行黨參種群間遺傳分化的研究奠定基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料

試驗所用黨參種苗于2011年10月采自甘肅定西渭源縣，以休眠芽為外植體進行組織培養，以試管苗的幼嫩莖葉作試材。

1.2 試劑

新型植物基因組DNA快速提取試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)，10×PCR Buffer、Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶(科昊生物工程有限責任公司)，ISSR引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)。

1.3 儀器

DYY-7型轉移電泳儀，DYCP-32型電泳槽，GelDox XR凝膠成像儀，Biometra-Tgradient PCR梯度擴增儀。

2 方法

2.1 基因組DNA的提取及檢測

用試劑盒法并略做修改提取DNA：(1)在1.5 μL離心管中加入450 μL溶液A，然后加入β-巰基乙醇2.26 μL；(2)取樣品70 mg，在研缽中加入液氮充分研磨成粉末狀；(3)將研磨好的粉末加到以上預備好的溶液A中，65 ℃水浴25 min，期間顛倒混勻樣品5次，(4)除RNA：水浴完后，加入10 μL RNase混勻，25 ℃下靜置10 min；(5)加入400 μL溶液B，充分混勻，常溫靜置5 min；12 000 rpm離心5 min；(6)除蛋白：加入500 μL氯仿，12 000 rpm離心5 min；(7)小心將上清轉到一個新的離心管中(勿將沉淀吸入)，加入600 μL異丙醇，充分混勻，室溫放置10 min；(8)12 000 rpm離心10 min，小心去上清(勿將DNA樣品的沉淀倒出)；(9)加入600 μL溶液C，顛倒混勻倆次，12 000 rpm離心5 min，棄廢液；(10)重復步驟(9)一次；(11)于室溫敞蓋放置，至無明顯乙醇味；(12)加入130 μL溶液D，離心管中即為基因組DNA溶液。在0.7%(M/V)瓊脂糖凝膠中電泳后成像，檢測提取的DNA質量，將質量好的于-20 ℃保存以備用。

2.2 ISSR-PCR反應的初始條件及程序

黨參ISSR-PCR體系的建立參考其它幾種藥用植物的ISSR-PCR反應體系[5-7]，確定初步的反應體系為：總體積25 μL，內含2.5 μL 10xPCR buffer，MgCl22.0 mmol·L-1，dNTPS 0.5 mmol·L-1，Primers 0.5 μmol·L-1，Taq DNA聚合酶0.5 U，模板DNA為30 ng。擴增程序為94 ℃預變性5 min，然后進行35個循環：94 ℃變性30 s，53.7 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，循環結束后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

2.3 退火溫度的確定

利用梯度PCR模式，設定退火溫度最低48.0 ℃，和最高58.0 ℃，擴增儀自動生成10個溫度梯度：48.5、48.7、49.4、50.5、51.7、52.9、54.1、55.3、56.4、57.5 ℃；其余PCR擴增程序同2.2項下，以確定最佳退火溫度。

2.4 ISSR-PCR反應體系的優化

黨參ISSR-PCR反應體系的優化采用單因素試驗，逐步確定體系中每個因素的最佳反應參數。MgCl2設以下5個濃度：1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol·L-1；dNTPs設以下5個濃度：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol·L-1；引物(845)濃度設以下5個濃度：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L-1；Taq DNA聚合酶設以下5個濃度0.5、1.0、1.5、2.0、2.5U；DNA模板的用量設以下5個：30、35、40、45、50 ng。

2.5 ISSR-PCR擴增產物的鑒定

取擴增產物6 μL和上樣緩沖液1 μL混勻后點樣，在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳分離，以0.5xTBE為緩沖液，穩壓100V，電泳至凝膠的2/3處結束。采用EB染色法染色20 min，在凝膠成像系統上照相。

3 結果與分析

3.1 黨參試管苗基因組DNA的提取

本試驗提取的DNA為無色沉淀，如圖1，各泳道點樣孔比較干凈，DNA條帶無拖尾，表明該方法所提的DNA質量較好，可用于ISSR-PCR體系優化的模板。

M：DNA marker 1～4為提取的基因組DNA 圖1 黨參基因組DNA的電泳結果

3.2 退火溫度對ISSR擴增的影響

退火溫度明顯影響ISSR-PCR反應的進行，不同引物的退火溫度通常也不一樣，以845為引物，進行退火溫度梯度試驗，由PCR梯度擴增儀自動生成10個溫度，確定了引物845以黨參基因組DNA為模板擴增的最佳退火溫度。由圖2可知，退火溫度為48.5、48.7 ℃時，背景有點模糊；溫度為49.4、50.5、51.7 ℃時，條帶清晰，亮度適宜；溫度為52.9 ℃時，條帶減少；溫度為54.1、55.3 ℃時，條帶之間界限不太明顯；溫度為56.4、57.5 ℃時，條帶減少，模糊不清。因此，退火溫度過高或過低都不利于產物擴增，在允許的范圍內，選擇較高的退火溫度可減少引物與模板之間的非特異性結合，提高反應的特異性，因此，引物845的最佳退火溫度為51.7 ℃，以下試驗均采用51.7 ℃的退火溫度。然后在這一條件下，研究ISSR-PCR反應中其他因素對擴增效果的影響，從中選擇確定最優的反應條件。

M：DNA marker 1～10溫度為48.5、48.7、49.4、50.5、 51.7、52.9、54.1、55.3、56.4、57.5 ℃ 圖2 退火溫度對ISSR擴增的影響

3.3 MgCl2濃度對ISSR擴增的影響

MgCl2濃度對ISSR-PCR反應的特異性和擴增效率均有較大的影響，在反應體系中MgCl2濃度過低，會顯著降低酶的活性，而MgCl2濃度過高時，又使酶催化非特異性擴增增強，試驗設5個MgCl2濃度梯度進行篩選，如圖3所示，MgCl2濃度為1.5 mmol·L-1時，擴增的條帶較少；MgCl2濃度為2.0 mmol·L-1時，能得到清晰穩定的條帶；MgCl2濃度為2.5～3.0 mmol·L-1時，擴增的產物只有個別幾條帶，而且模糊不清；MgCl2濃度為3.5 mmol·L-1時，條帶較暗。因此，選擇2.0 mmol·L-1MgCl2作為黨參ISSR-PCR反應體系的最佳濃度。

M：DNA marker 1～5 MgCl2濃度分別為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol·L-1圖3 MgCl2濃度對ISSR擴增的影響

3.4 dNTPs濃度對ISSR擴增的影響

適宜的dNTPs對于獲得理想的ISSR-PCR擴增產物尤為重要，如圖4所示，當dNTPs濃度為0.1～0.2 mmol·L-1時，擴增條帶少且較弱；在0.3～0.5 mmol·L-1時，條帶多而清晰，多態性好，相對而言0.5 mmol·L-1更清晰些；所以本試驗選擇0.5 mmol·L-1的dNTPs濃度作為黨參ISSR反應體系的最佳濃度。

3.5 引物濃度對ISSR擴增的影響

引物濃度對PCR擴增的帶型有明顯的影響，濃度過低會導致ISSR-PCR產物量降低；而引物量過高，則會引起堿基錯配和非特異性的擴增，生成引物二聚體，從而使目的DNA片段的擴增量下降。如圖5所示，當引物濃度為0.1 μmol·L-1時的擴增條帶最少；當引物濃度為0.2～0.3 μmol·L-1時，擴增條帶較少，而且條帶不清晰；濃度為0.4～0.5 μmol·L-1時，條帶多而清晰，相對而言以0.4 μmol·L-1的條帶最清晰明亮；因此，選擇0.4 μmol·L-1的引物濃度作為黨參ISSR-PCR反應體系的最佳濃度。

M：DNA marker 1～5 dNTPs濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol·L-1圖4 dNTPs濃度對ISSR擴增的影響

M：DNA marker 1～5引物濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmmol·L-1圖5 引物濃度對ISSR擴增的影響

3.6 Taq DNA聚合酶對ISSR擴增的影響

Taq DNA聚合酶在ISSR-PCR體系中的加入量也很重要，若量過少會影響靶序列擴增產量，而過多則會導致非特異性的擴增；如圖6所示，Taq DNA聚合酶用量為0.5 U時擴增條帶少而不清晰；Taq DNA聚合酶用量在1.0 U的條帶背景較1.5～2.5 U的清晰，1U時的擴增條帶明顯，反應穩定；因此，選擇1.0 U的Taq DNA聚合酶濃度作為黨參ISSR-PCR反應體系的最佳濃度。

3.7 模板DNA的用量對ISSR擴增的影響

模板DNA用量對ISSR-PCR擴增產物的特異性和穩定性影響不大，如圖7所示，本試驗提取的DNA用量為30～50 ng的范圍內，均可擴增出條帶清晰的產物，因此30～50 ng的DNA模板均適合黨參基因組DNA PCR反應的用量，相對而言，DNA用量30 ng時擴增條帶較明顯，因此本試驗選擇DNA用量為30 ng作為黨參ISSR-PCR反應體系的最佳濃度。

M：DNA marker 1～5 Taq DNA聚合酶濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 U 圖6 Taq DNA聚合酶對ISSR擴增的影響

M：DNA marker 1～5 模板DNA的用量分別為30、35、40、45、50 ng 圖7 模板DNA的用量對ISSR擴增的影響

4 結論與討論

4.1本試驗以黨參基因組DNA為材料，建立了分辨率高、可靠性好的黨參ISSR-PCR反應體系，即在25 μL反應體系中，含有10×PCR Buffer緩沖液2.5 μL，MgCl22.0 mmol·L-1，dNTPs 0.5 mmol·L-1，引物0.4μ mol·L-1，Taq DNA聚合酶1.0 U，模板DNA為30 ng；通過梯度退火得到引物845的最佳退火溫度為51.7 ℃；擴增程序為：94 ℃預變性5 min，然后94 ℃變性30 s，51.7 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共計35個循環，循環結束后在72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。得到了清晰，多態性高的ISSR譜帶，為ISSR-PCR在黨參的分類鑒定和育種學研究中的應用奠定了基礎。

4.2ISSR分子標記技術基于PCR反應，它具有以下優點：不需要事先知道靶序列；由于較高的退火溫度和更長的引物序列，可產生重復性好的擴增帶；模板需要量少，多態性豐富，結果記錄方便。目前已廣泛應用于植物品種鑒定，遺傳圖譜和遺傳多樣性等方面的研究。但影響ISSR擴增結果的因素較多，各因素的變化會不同程度地影響到帶譜的準確性與穩定性[8]，因此，有必要對其影響因子進行篩選和優化，確立最適宜的ISSR反應體系。退火溫度對擴增條帶的清晰程度和條帶數目有明顯影響。引物的堿基構成不同，適宜的退火溫度就可能不同，因此，只有針對不同的引物進行相應的退火溫度設計、優化，才能獲得清晰、穩定的擴增帶。模板濃度在30～50 ng之間擴增結果相同，紅松ISSR-PCR實驗系統影響因素研究一文中發現模板濃度在10～200 ng之間擴增結果相同[9]，說明ISSR-PCR對模板濃度的要求范圍較寬，具有較好的可重復性和穩定性。

[1] 周秀佳，徐宏發，順慶生.中藥資源[M].上海：上海科學技術文獻出版社，2007.

[2] 王崢濤，徐國鈞.中藥黨參的藥源調查[J].醫學教育探索，1992，(3)：144-147.

[3] 王延華，Pierre Dubus.PCR理論與技術[M].北京：科學出版社，2009.

[4] 李海生.ISSR分子標記技術及其在植物遺傳多樣性分析中的應用[J].生物學通報，2004，39(2)：19-21.

[5] 邱英雄，傅承新，吳斐捷.明黨參與川明參群體遺傳結構及分子鑒定的ISSR分析[J].中國中藥雜志，2003，28(7)：598-603.

[6] 隋春，魏建和，陳士林，等.柴胡ISSR-PCR反應體系的建立與優化[J].時珍國醫國藥，2008，19(8)：1837-1839.

[7] 郭丁丁，馬逾英，唐琳，等.白芷ISSR-PCR反應體系的建立和優化[J].成都中醫藥大學學報，2008，31(2)：45-48.

[8] 鄧婧，陳新.黃花蒿ISSR-PCR反應體系的優化[J].成都中醫藥大學學報，2006，29(3)：51-53.

[9] 馮富娟，王鳳有，劉彤.紅松ISSR-PCR實驗系統影響因素[J].植物學通報，2004，21(3)：326-331.

Establishment and Optimization of ISSR-PCR Reaction System for Codonopsis Pilosula(Franch.)Nannnf.

ZHANG Yanhong*，GAO Sufang

(DepartmentofPharmacy，GansuCollegeofTCM，Lanzhou730000，China)

Objective：The study focused on setting up ISSR-PCR reaction system ofCodonopsispilosula(Franch.)Nannnf.，which will provide a standard procedure for Codonopsis germplasm resources analysis.MethodsDNA ofC.pilosulawas extracted by kit method，and the influence of MgCl2，dNTPs，primer concentration，Taq DNA polymerase，DNA template amount and the annealing temperature on ISSR-PCR amplification were studied by single factor experiment.ResultsThe optimal reaction system for ISSR analysis contains 10×PCR Buffer 2.5 μL，2.0 mmol·L-1MgCl2，0.5 mmol·L-1dNTPs，0.4 μmol·L-1primer，1.0 U Taq DNA polymerase，30 ng template DNA，in 25 μL total reaction volume.Amplification procedure is：94 ℃ initial denaturation 5 min，and then 94 ℃ denaturation 30 s，51.7 ℃ annealing 1 min，72 ℃ extends 1.5 min，total of 35 cycles，after the cycles extension for 7 min at 72 ℃，storing at 4 ℃.ConclusionThe stable and reproducible optimal ISSR-PCR reaction system was established forC.pilosula，which laid a good foundation for germplasm resources identification，molecular marker assisted breeding and genetic diversity study.

Codonopsispilosula(Franch.)Nannnf.；ISSR-PCR；Reaction system；Optimization

“十二五”國家科技支撐計劃課題(2011BAI05B02)

*

張延紅，副教授，研究方向：藥用植物育種和組織培養，Tel：(0931)8765393，E-mail：zhyh456789@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.07.008

2014-02-08)