當歸貝母苦參丸對順鉑化療H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及對血清HIF-1α和LDH的影響

閆德祺，劉永琦，2，3*，李應東，李 豆，藺興遙，伍志偉，顏春魯

(1.甘肅中醫學院系統生物學與中醫藥轉化研究所，甘肅蘭州 730020;2.甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室中西醫結合基礎室，甘肅蘭州 730020;3.敦煌醫學與轉化省部共建教育部重點實驗室，甘肅蘭州 730020)

惡性腫瘤嚴重危害人們的生命健康，患者死亡率高。惡性腫瘤在中醫學中多屬積的范疇，按發病進展分為氣滯血阻、瘀血內結、正虛瘀結3個證型，分別予以理氣通絡、活血消積;祛瘀軟堅、調理脾胃;補益氣血、活血化瘀。當歸貝母苦參丸首見于《金匱要略·婦人妊娠病脈證并治第二十》，該方由當歸、貝母、苦參三味藥物組成，具有養血和血、清熱燥濕、化痰散結、利竅開閉之功效。現代醫家將當歸貝母苦參丸運用于肺癌、膀胱癌、前列腺癌、宮頸癌等疾病的治療中，取得了較好的臨床療效［1，2］。本課題研究了當歸貝母苦參丸對KM小鼠皮下移植瘤的抑瘤作用及對順鉑化療的增效減毒作用，檢測了荷瘤小鼠血清中的低氧誘導因子(Hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)水平和乳酸脫氫酶 (lactate dehydrogenase，LDH)的活力。

1 材料

1.1 動物 SPF級昆明小鼠100只，雌雄各半，體質量20～22 g，由甘肅中醫學院SPF級動物實驗中心提供;動物合格證號 SCXK(甘)2011-0001;SPF級動物實驗設施使用證號 SYXK(甘)2011-0001。

1.2 細胞株 H22肝癌瘤株由甘肅中醫學院中西醫結合研究所傳代培養。

1.3 藥物與試劑 CO2培養箱 (法國NAPCO公司)，RPMI1640(美國 Invitro公司);順鉑注射液，10 mg/支，齊魯制約有限公司 (批號201002CF);HIF-1α試劑盒，上海源葉生物科技有限公司 (批號20121001A);LDH試劑盒，南京建成生物工程研究所 (批號20121011)。當歸貝母苦參丸為自制湯劑 (每1 mL藥液相當于0.45 g生藥，當歸、貝母、苦參各0.15 g/mL)。

1.4 儀器 SW-CJ-IF超凈臺 (中國蘇州凈化設備廠);電子天平 (LD100001，龍騰電子有限公司);Abacus Junior vet 5動物血清分析儀 (蘭橋醫療);酶標儀 (680型，美國BD-RAD公司);UV1101紫外-可見分光光度儀 (上海天美科學有限公司)。

2 方法

2.1 當歸貝母苦參丸湯劑的制備 將當歸、貝母、苦參飲片各15 g放在陶土藥鍋中，加500 mL去離子水浸泡30 min，煎藥1 h，將藥液倒入燒杯中，再加500 mL去離子水浸泡30 min，煎藥1 h，將兩次煎出液混合后在水浴鍋中水浴加熱濃縮到100 mL，高壓滅菌。藥物質量濃度按生藥量計算為0.45 g/mL。

2.2 動物模型制備 KM小鼠適應環境4 d后，按隨機數字表法分出雌雄各8只，設為正常對照組，其他小鼠造模。取傳代9 d的腹水型 H22小鼠腹水離心棄上清，用生理鹽水調至細胞密度為2×106個/mL。將H22肝癌細胞懸液 0.2 mL接種于昆明小鼠右前腋皮下，細胞計數約為4×105個，以出現皮丘為皮下接種部位正確。觀察小鼠接種部位的腫瘤生長情況5～7 d，接種部位可觸及結節為接種成功［3］。

2.3 模型動物分組及處理 第8天剔除接種不成功的小鼠［3］，隨機挑選接種成功的小鼠，雌雄各32只隨機分為模型對照組、順鉑組、當歸貝母苦參丸組和當歸貝母苦參丸加順鉑組，每組雌雄各8只。分組后稱定質量，模型對照組灌胃和腹腔注射生理鹽水0.4 mL/20 g，0.2 mL/20 g;順鉑組灌胃生理鹽水0.4 mL/20 g，以2.0 mg/(kg·d)腹腔注射順鉑0.2 mL/20 g;當歸貝母苦參丸組以9 g/(kg·d)灌胃0.4 mL/20 g當歸貝母苦參丸藥液，腹腔注射生理鹽水0.4 mL/20 g;當歸貝母苦參丸加順鉑組以9 g/(kg·d)灌胃當歸貝母苦參丸藥液，腹腔注射2.0 mg/(kg·d)順鉑0.2 mL;連續給藥14 d。

2.4 指標檢測

2.4.1 小鼠一般狀態觀察及計算 觀察小鼠生存狀態，記錄小鼠的神態、發育、營養、活動、飲食、二便等，反映小鼠的一般情況。記錄開始給藥第1天和處死時的體質量，計算治療前后的體質量變化。體質量變化=處死時的體質量-分組給藥時的體質量。有效體質量變化=處死時的體質量-腫瘤質量-分組給藥時的體質量。

2.4.2 計算抑瘤率、q值、腫瘤指數、器官指數剝離瘤體組織，摘取肝、脾、腎、胸腺后分別稱質量。計算抑瘤率、腫瘤、肝臟、腎臟、脾臟、胸腺等的指數。抑瘤率 (%)=(模型對照組平均瘤質量 -實驗組平均瘤質量)/模型對照組平均瘤質量。q=EAB/［EA+(l-EA)EB］。式中EA為A藥(當歸貝母苦參丸)抑瘤率，EB為B藥 (順鉑)抑瘤率，EAB為聯合用藥組兩藥合用的抑瘤率，q=0.85～1.15為兩藥作用相加，q＞1.25為兩藥作用增強 (或協同)，q＜0.85為兩藥拮抗［4］。器官指數=器官質量 (mg)/體質量 (g)。

2.4.3 血常規檢測 在1.5 mL離心管中加入生理鹽水80 μL，滴加20 μL新鮮血液，以動物血清分析儀檢測血常規。

2.4.4 HIF-1α和LDH檢測 按照ELISA試劑盒說明書檢測血清HIF-1α，按照血生化說明書檢測血清LDH。

2.5 統計學處理 樣本實驗數據以 (平均值±標準差)表示，應用SPSS 17.0統計軟件進行單因素方差分析。

3 結果

3.1 荷瘤小鼠的一般狀況 接種成功后，瘤塊體積逐漸增大，外觀呈球形。初期能活動，后來大多逐漸變硬。分組前荷瘤小鼠身形較勻稱 (瘤體隆起處除外)，動作敏捷，反應靈活，皮毛光滑，進食進水較正常;分組7 d，隨著實驗時間的繼續延長，順鉑組小鼠最先出現精神萎靡，飲食活動減少，聚集一團，皮毛成揪失去光澤，下腹部不潔凈，尿液變黃等現象。模型組負荷瘤體最大，活動減少。給藥結束時各組小鼠一般狀況從正常到差排序:正常組、當歸貝母苦參丸組、當歸貝母苦參丸加順鉑組、模型組、順鉑組。

3.2 各組小鼠療前后體質量和有效體質量的變化見表1。

表1 各組小鼠體質量及有效體質量變化比較 ()Tab.1 Changes in body weight and tumor-free body weight of each group()

表1 各組小鼠體質量及有效體質量變化比較 ()Tab.1 Changes in body weight and tumor-free body weight of each group()

注:與空白對照組比較，●P ＜0.05;與模型組比較，*P＜0.05;與順鉑組比較，ΔP＜0.05;與當歸貝母苦參丸組比較，▲P ＜0.05

有效體質量變化空白對照組組別 樣本數 首次給藥體質量/g 處死時體質量/g 體質量變化/g 16 31.8±1.2 40.0±2.8 8.1±2.4 8.1±2.4模型對照組 16 29.4±0.9 37.5±1.2 8.1±1.2 2.5±1.7●順鉑組 16 29.8±1.3 22.5±1.2● -6.3±2.2●＊ -8.5±2.3●＊當歸貝母苦參丸組 16 29.6±1.1 35.6±3.0Δ 6.1±2.4Δ 2.7±1.9Δ當歸貝母苦參丸加順鉑組 16 29.4±1.3 26.9±1.8●＊▲ -2.5±1.3●＊Δ▲ -4.3±1.4●＊Δ▲

3.4 荷瘤小鼠器官指數比較 見表3。

3.5 荷瘤小鼠白細胞計數比較 見表4。

3.6 荷瘤小鼠血清HIF-1α水平和LDH活力 見表5。

表2 各組瘤體質量 ()及抑瘤率的比較Tab.2 Tumor weight()and tumor inhibition rate of each group

表2 各組瘤體質量 ()及抑瘤率的比較Tab.2 Tumor weight()and tumor inhibition rate of each group

注:與模型組比較，*P＜0.05;與順鉑組比較，ΔP＜0.05;與當歸貝母苦參丸組比較，▲P ＜0.05

組別 樣本數 瘤體質量/g 腫瘤指數/(mg·g-1) 抑瘤率/%16 5.5±1.3 148.6±35.9順鉑組 16 2.2±0.6* 93.0±24.4* 60.0當歸貝母苦參丸組 16 3.4±1.0*Δ 95.1±19.4* 38.2當歸貝母苦參丸加順鉑組 16 1.8±0.6*Δ 66.9±11.8*Δ，▲模型對照組67.2

表3 肝癌H22荷瘤小鼠肝臟指數、腎臟指數、脾臟指數、胸腺指數 ()Tab.3 Indexes of liver，kidney，spleen，thymus of each group()

表3 肝癌H22荷瘤小鼠肝臟指數、腎臟指數、脾臟指數、胸腺指數 ()Tab.3 Indexes of liver，kidney，spleen，thymus of each group()

注:與空白對照組比較，●P＜0.01;與模型對照組比較，*P＜0.01;與順鉑組比較，ΔP＜0.05;與當歸貝母苦參丸組比較，▲P＜0.05

組別 樣本數 肝臟指數/(mg·g-1) 脾臟指數/(mg·g-1) 腎臟指數/(mg·g-1) 胸腺指數/(mg·g-1)16 39.8±8.0 3.5±0.5 5.0±1.2 3.0±0.9模型對照組 16 69.2±7.2● 10.3±3.4● 4.8±1.0 2.8±0.6順鉑組 16 53.9±8.9 2.3±0.7* 5.2±0.8 0.8±0.2●當歸貝母苦參丸組 16 67.9±9.8● 11.5±4.4●Δ 5.3±0.8 2.5±0.6Δ當歸貝母苦參丸加順鉑組 16 66.1±6.8● 3.5±0.5＊▲ 5.3±0.8 1.3±0.4●＊Δ▲空白對照組

表4 肝癌H22荷瘤小鼠白細胞計數 (n=10，)Tab.4 Blood white cell count of each group(n=10，)

表4 肝癌H22荷瘤小鼠白細胞計數 (n=10，)Tab.4 Blood white cell count of each group(n=10，)

注:與空白對照組比較，●P＜0.01;與模型對照組比較，*P＜0.01;與順鉑組比較，ΔP＜0.05;與當歸貝母苦參丸組比較，▲P＜0.05

組別 白細胞/(109·L-1) 淋巴細胞/(109·L-1) 單核細胞/(109·L-1) 中性粒細胞/(109·L-1)3.74±1.52 2.32±0.93 0.13±0.13 1.30±0.27模型對照組 24.68±1.37● 15.57±1.40● 1.46±0.65● 7.67±1.6●順鉑組 6.16±1.65●＊ 4，97±1.60●＊ 0.06±0.04●＊ 1.11±0.80*當歸貝母苦參丸組 11.74±3.9●＊Δ 5.20±0.87●＊ 0.49±0.58●＊Δ 6.05±3.30●Δ當歸貝母苦參丸加順鉑組 7.06±1.11●＊▲ 4.20±1.09●＊ 0.32±0.17●＊Δ 2.54±1.64●＊Δ▲空白對照組

表5 各組小鼠血清HIF-1α水平、LDH活力比較 ()Tab.5 HIF-1α serum level and LDH activity of each group()

表5 各組小鼠血清HIF-1α水平、LDH活力比較 ()Tab.5 HIF-1α serum level and LDH activity of each group()

注:與空白對照組比較，●P＜0.05;與模型組比較，*P＜0.05;與順鉑組比較，ΔP＜0.05

組別 樣本數 HIF-1α/(pg·mL-1) LDH/(μ·L-1)10 4.061±0.640 3999.35±295.55模型對照組 10 7.298±0.838● 3631.56±262.03順鉑組 10 3.443±1.159* 7456.70±506.58●＊當歸貝母苦參丸組 10 4.842±0.470* 3837.41±1069.62Δ當歸貝母苦參丸+順鉑組 10 3.769±0.877* 3791.45±1048.28空白對照組Δ

4 討論

本研究中小鼠移植瘤于注射瘤細胞懸液5～7日形成，符合中醫濕濁癌毒瘀久化熱，導致痰濁凝結，脾失健運，不能升清化生精微，氣血生化乏源，氣血陰陽失調，氣虛無力推動血液運行，氣滯痰凝、瘀血內停，癌毒客居發展而生積聚的理論。治當活血化瘀，化痰散結，清熱燥濕，攻癌殺毒，符合《內經》“堅者消之，留者攻之，結者散之，客者除之”及“熱者寒之”的原則。當歸貝母苦參丸始載于《金匱要略》，由當歸、貝母、苦參等比例組成，具有養血和血、化痰散結、清熱燥濕的功效。順鉑攻殺癌毒力強，為君藥。順鉑性熱易耗傷陰津氣血，煉液生痰，臣以當歸養血活血維持氣血通暢，佐以貝母清熱化痰保護肺臟布散津液、苦參清熱燥濕維持脾臟生化氣血，能收到較好抗癌療效。

精血同源，皆由水谷精氣化生或培育補充，二者可相互滋生和轉化。當歸具有補血的功效，血旺使心肌等組織得到濡養，減少順鉑所致心肌組織損傷［5］。血能生精，使腎有所藏，腎氣則旺。腎氣健旺，則腎主骨生髓的功能得以恢復，為減輕順鉑化療引起的西醫上的腎毒性［6-7］、耳毒性［8-9］、性腺抑制［10］、骨髓抑制［11］、神經毒性［12-13］提供了中醫學依據。苦參苦寒配以甘溫制其性味，使燥濕之功力專，有益于脾胃后天之本功能的發揮，減輕順鉑引起的惡心、厭食、嘔吐等消化系統癥狀，增加順鉑化療荷瘤小鼠的體質量，改善荷瘤小鼠的生存狀態。現代研究表明當歸及其萃取物當歸多醣能夠提高機體細胞和體液免疫［14］。苦參堿和苦參酮能夠抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞分化和凋亡，抑制腫瘤轉移，調節免疫功能［15］。當歸貝母苦參丸能夠拮抗順鉑化療引起的脾臟指數和胸腺指數降低，有升高脾臟指數和胸腺指數的作用，對荷瘤小鼠重要免疫器官具有一定的保護作用，可能與調節免疫的活性成分有關。

惡性腫瘤的治療療效與腫瘤細胞耐受缺氧的能力及化療損傷有關。HIF-1α是細胞對低氧的適應性反應，能夠促進腫瘤組織代謝產物的清除及血管生成，其表達激活有助于腫瘤血管的生成和腫瘤細胞的轉移，預后差［16］。HIF-1α是腫瘤治療的靶點之一，各給藥組HIF-1α的水平下調，使腫瘤細胞耐受低氧的腫瘤微環境能力下降，影響腫瘤細胞內代謝產物的清除，有利于抑制腫瘤的生長［17］。Elberry等［18］的研究結果表明，對大鼠應用順鉑72 h后可以檢測到明顯的腎臟組織病理損傷，血清LDH水平顯著升高，與本實驗順鉑組血清LDH水平升高一致，而當歸貝母苦參丸加順鉑組未檢測出LDH水平升高，或許與其減輕了順鉑損傷組織的程度有關。

研究具有抑瘤作用及對化療藥物具有增效減毒作用的中藥及其復方逐漸成為中醫藥研究的熱點。

［1］李宜放，高向軍，王晞星.王晞星應用當歸貝母苦參丸治療腫瘤的經驗［J］.山西中醫，2011，27(12):4-7.

［2］石 彧，范先基.王三虎用當歸貝母苦參丸治療婦科腫瘤的經驗［J］.中醫雜志，2006，47(5):344.

［3］陳 奇.中藥藥效研究思路與方法［M］.北京:人民衛生出版社，2005:1002.

［4］徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學［M］.北京;人民衛生出版社，2002:1757.

［5］El-Awadyel S E，Moustafa Y M，Abo-Elmatty D M，et al.Cisplatin-induced cardiotoxicity:Mechanisms and cardioprotective strategies［J］.Eur J Pharmacol，2011，650(1):335-341.

［6］Kilic U，Kilic E，Tuzcu Z，et al.Melatonin suppresses cisplatin-induced nephrotoxicity via activation of Nrf-2/HO-1 pathway［J］.Nutr Metab(Lond)，2013，10(1):7.

［7］Pezeshki Z，Nematbakhsh M，Mazaheri S，et al.Estrogen abolishes protective effect of erythropoietin against cisplatin-induced nephrotoxicity in ovariectomized rats［J］. ISRN Oncol，2012:890310.

［8］Duval M，Daniel S J.Meta-analysis of the efficacy of amifostine in the prevention of cisplatin ototoxicity［J］.J Otolaryngol Head Neck Surg，2012，41(5):309-315.

［9］Schacht J，Talaska A E，Rybak L P.Cisplatin and aminoglycoside antibiotics:hearing loss and its prevention［J］.Anat Rec(Hoboken)，2012，295(11):1837-1850.

［10］García M M，Acquier A，Suarez G，et al.Cisplatin inhibits testosterone synthesis by a mechanism that includes the action of reactive oxygen species(ROS)at the level of P450scc［J］.Chem Biol Interact，2012，199(3):185-191.

［11］Elaine A L，Cristina M S，álvaro D C，et al.Encapsulation of cisplatin in long-circulating and pH-sensitive liposomes improves its antitumor effect and reduces acute toxicity［J］.Int J Nanomedicine，2012，7:5259-5269.

［12］Mendon?a L M，Silva M C，Correia T C，et al.Curcumin reducescisplatin-induced neurotoxicity in NGF-differentiated PC12 cells［J］.Neurotoxicology，2013 ，34:205-211.

［13］Gilchrist L S，Tanner L.The pediatric-modified total neuropathy score:a reliable and valid measure of chemotherapy-induced peripheral neuropathy in children with non-CNS cancers［J］.Support Care Cancer，2013，21(3):847-856.

［14］Qin T，Chen J，Wang D，et al.Selenylation modification can enhance immune-enhancing activity of Chinese angelica polysaccharide［J］.Carbohydr Polym，2013，95(1):183-187.

［15］Mingyu S，Hongyan C，Lin S，et al.Antitumor activities of Kushen:literature review［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2012，2012:373219.

［16］Gu J W，Makey K L，Tucker K B，et al.EGCG，a major green tea catechin suppresses breast tumor angiogenesis and growth via inhibiting the activation of HIF-1α and NFκB，and VEGF expression ［J］.Vasc Cell，2013，5(1):9.

［17］Zheng Y，Ni Y，Huang X，et al.Overexpression of HIF-1α indicates a poor prognosis in tongue carcinoma and may be associated with tumor metastasis ［J］.Oncol Lett，2013，5(4):1285-1289.

［18］Elberry A A，Refaie S M，Kamel M，et al.Oxytocin ameliorates cisplatin-induced nephrotoxicity in Wistar rats［J］.Ann Saudi Med，2013，33(1):57-62.