HPLC法測定兔房水中羥基紅花黃色素A

何梅鳳，吳 偉，鄧新國

(中山大學中山眼科中心，廣東廣州 510060)

羥基紅花黃色素A具有抗凝、抗缺氧、降血壓、改善心腦血管供血不足等作用，臨床可用于防治心肌缺血、腦缺血、冠心病、腦血栓等疾病［1-3］。近年來隨著對羥基紅花黃色素A藥理作用機理研究的日益深入，在眼科方面也取得一定進展，羥基紅花黃色素A可在體外保護晶狀體免受氧化損傷，阻止脂質過氧化過程和白內障的形成［4］;在高糖下如糖尿病視網膜病變中可能抑制新生血管的生成，有望成為糖尿病視網膜病變的有效治療藥物［5］，顯示出其在眼科疾病的治療有很好的應用前景。目前，關于羥基紅花黃色素A在體內定性、定量測定的分析方法已有報道［6］，但以血樣中的量測定為主，全身用藥在眼房水中的吸收情況尚未見報道。本實驗采用紅花黃色素A兔靜脈注射并測定了房水中藥物濃度，為其在眼科的臨床應用提供參考依據，現將結果報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀及其化學工作站(美國Agilent公司);TGL－16G臺式離心機 (上海安亭科學儀器廠);SK-1型快速混勻器 (江蘇金壇醫療儀器廠);電子分析天平 (德國Sartorius公司)。

1.2 藥品與試劑 羥基紅花黃色素A對照品 (中國食品藥品檢定研究院，批號111637-201106，純度92.5%);注射用紅花黃色素 (浙江永寧藥業股份有限公司，批號110610);乙腈、甲醇為色譜純;磷酸為分析純;水為注射用水。

1.3 實驗動物 新西蘭兔由廣州市花都區花東信華實驗動物養殖場提供。

2 方法與結果

2.1 羥基紅花黃色素A對照品溶液的配制 取羥基紅花黃色素A對照品適量，精密稱定，加25%甲醇溶解并稀釋至每1 mL含5.60 μg的溶液，即得。

2.2 給藥及樣品采樣 取3只新西蘭兔，靜脈注射紅花黃色素10 mg/kg，30 min后，采取耳緣靜脈空氣栓塞處死兔，取房水置－20℃冰箱備用。

2.3 房水樣品的處理 分別取兔房水0.2 mL，各加6%高氯酸0.2 mL，漩渦振蕩混勻1 min，10000 r/min離心10 min，取上清液20 μL進樣測定。

2.4 色譜條件及方法的專屬性考察 色譜柱為Diamonsil C18柱;流動相為甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液 (26∶2∶72);體積流量為0.8 mL/min;檢測波長為403 nm;柱溫為50℃;進樣量20 μL。在上述色譜條件下，分別取空白房水樣品、羥基紅花黃色素A對照溶液以及房水樣品進樣，記錄色譜圖，結果顯示，羥基紅花黃色素A的保留時間約為11 min，峰尖而對稱，無其他峰干擾，表明該方法可行。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.5 線性范圍 分別精密量取對照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，分別取溶液20 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積。將峰面積 (A)與質量濃度 (C)做線性回歸，得羥基紅花黃色素A的線性回歸方程為:A=69.1588 C–0.6947，相關系數r=0.9998。結果表明，羥基紅花黃色素A在0.28～4.48 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.6 回收率試驗 取兔空白房水，分別精密加入羥基紅花黃色素A對照品溶液和甲醇，配制高、中、低3個質量濃度的羥基紅花黃色素A房水液，按“樣品處理”項下操作并進行分析，求得羥基紅花黃色素A在空白房水中的回收率。結果見表1。

表1 回收率試驗結果 (n=3)

2.7 精密度試驗 取高、中、低3個質量濃度的羥基紅花黃色素A房水液，于日內的不同時間和不同的日間分別進樣5次，考察日內與日間的精密度，結果日內精密度為3.85%、3.48%、5.04%，日間精密度為5.13%、4.26%、5.61%(n=5)。

2.8 穩定性試驗［7-8］取高、中、低3個質量濃度的羥基紅花黃色素A房水液，于室溫放置0、6、12 h及在－20℃冷凍保存3 d后，分別經樣品處理并測定羥基紅花黃色素A的質量濃度，結果表明具有良好的穩定性，RSD＜6.5%。

2.9 樣品測定 取靜脈注射紅花黃色素30 min后的兔眼房水樣品 (6只眼)，按“2.3”項處理，測定羥基紅花黃色素A在房水中的濃度，具體結果見表2。

表2 房水中羥基紅花黃色素A測定結果 (n=6，)

表2 房水中羥基紅花黃色素A測定結果 (n=6，)

樣品號 羥基紅花黃色素A/(μg·mL－1) 平均/(μg·mL－1)12.5822.2532.1142.1752.7162.822.44±0.3

3 討論

紅花黃色素為紅花中多種水溶性查爾酮成分的混合物，而羥基紅花黃色素A是其混合物中主要的有效成分，因此，羥基紅花黃色素A常作為應用紅花黃色素后在體內某組織的濃度的考察指標。目前，羥基紅花黃色素A的測定多采用高效液相色譜法［9-14］，但色譜條件及樣本處理方法各有不同，主要采用甲醇-乙腈-0.2%磷酸水溶液，乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液，乙腈-甲醇-水，甲醇-乙腈-1.2% 磷酸二氫鉀溶液以及甲醇-水-冰醋酸等不同的配比作為流動相，而樣品處理多采用高氯酸，也有采用乙腈和甲醇處理生物樣本后對羥基紅花黃色素A進行測定。

本研究參照《中國藥典》項下的流動相組成［15］，并對柱溫和體積流量加以優化，選用高氯酸沉淀房水中的微量蛋白，甲醇－乙腈－0.7%磷酸溶液 (26∶2∶72)為流動相，在波長為403 nm下對兔靜脈注射房水中的羥基紅花黃色素A質量濃度進行了測定，通過方法學驗證，本方法具有準確、可靠、快速等優點，適用于對房水羥基紅花黃色素A的測定。研究結果表明，羥基紅花黃色素A通過靜脈注射能透過血眼屏障，進入房水，這一結果為其全身用藥治療眼部疾病提供了實驗依據。后續將進一步研究羥基紅花黃色素A在房水中的藥動學行為，為臨床合理用藥提供參考。

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