川芎嗪對人結腸癌LoVo細胞增殖與凋亡的影響

萬慧芳，余 波，涂 碩，余樂涵，萬福生(南昌大學醫學院，江西南昌 330006)

結腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一，在世 界上被列為第三大惡性腫瘤。在我國，隨著人們生活水平的提高和飲食結構的改變、環境污染的加重，結直腸癌的發病率與死亡率均有呈逐年上升趨勢。中藥在腫瘤的治療方面有其獨特的療效，且副作用小，深受廣大腫瘤患者的好評。川芎嗪 (tetramethylpyraxine)是活血化瘀中藥川芎中的一種生物堿，具有擴張血管、抗氧化及改善微循環等藥理作用，在臨床上的應用范圍較廣［1-3］。近年研究發現［4-9］，川芎嗪具有抗腫瘤，抑制腫瘤轉移及提高藥物敏感性等作用，但其作用機制尚未闡明。p53正向凋亡調節因子 (p53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA)在藥物誘導腫瘤細胞凋亡過程中發揮著重要作用，它是否參與川芎嗪抗結腸癌的作用尚未見報道。本實驗旨在觀察川芎嗪對人結腸癌LoVo細胞增殖與凋亡的影響及其初步機制。

1 材料和方法

1.1 試劑和抗體 人結腸癌細胞LoVo(p53+/+)和正常人胚腎細胞293T均購自中國科學院細胞庫。川芎嗪注射液為山東濰坊制藥有限公司 (批號120514)產品，DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Dulbecco)培養基以及胎牛血清均購于GIBCO公司，cDNA逆轉錄試劑盒購于Fermentas公司，GAPDH多抗 (TA-08)、Bcl-2單抗 (sc-783)和Bax單抗 (sc-526)均購于Santa Cruz公司，p53正向凋亡調節因子 (PUMA)多抗 (#Q9 BXH1)購于Cell Signaling Technology公司，辣根酶標記山羊抗鼠 IgG(ZDR-5307)和辣根酶標記山羊抗兔IgG(ZDR-5306)購于北京中杉金橋公司。

1.2 細胞及藥物處理 LoVo細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基，在37℃，5%CO2條件下培養。依據本研究室以前的實驗結果［1-3］，本研究采用0.25～4.0 mg/mL梯度的川芎嗪分別作用24 h、48 h和72 h處理LoVo細胞。又依據MTT結果(作用24 h、48 h及72 h的結果未見顯著性差異，故后續實驗僅選擇作用48 h)，選用1.0、2.0、4.0 mg/mL質量濃度的川芎嗪分別作用LoVo細胞48 h，并觀察川芎嗪對細胞凋亡率、PUMA、Bax、及Bcl-2基因表達的影響。

1.3 MTT比色法檢測細胞存活率 將對數期生長的細胞接種在96孔板內，使細胞密度至5000～8000個/孔，每組設3個重復孔。次日，加入不同質量濃度川芎嗪藥物，川芎嗪組質量濃度分別為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL，作用時間分別24、48、72 h，對照組加等體積培養基。然后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，繼續培養4 h后終止。用150 μL DMSO充分溶解結晶。酶標儀上在490 nm波長處檢測各孔的OD值，并計算抑制率。

1.4 流式細胞術檢測腫瘤細胞凋亡率 收集對照組及經藥物處理48 h后的各組細胞，加入500 μL Binding Buffer懸浮細胞。然后，加入5 μL Annexin V-FITC，混勻后再加5 μL Propidium Iodide，混勻。室溫避光反應5～15 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.5 RT-PCR檢測腫瘤細胞PUMA及Bax、Bcl-2 mRNA的表達 按照Invitrogen/TRIzol試劑盒說明進行操作，先提取總RNA，并按Fermentas試劑盒說明制備 cDNA，然后進行 PCR擴增，最后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。用凝膠成像系統拍照，Launch SensiAnsys凝膠分析系統軟件分析，以GAPDH條帶為參照，計算并比較各組目的基因的相對表達量。

1.6 Western blot檢測PUMA及Bax、Bcl-2蛋白的表達 收集細胞和提取蛋白，沸水浴使之變性，然后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠 (SDSPAGE)電泳，每孔加樣量總蛋白量為30 μg。隨后用濕轉法將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上。然后將膜與 PUMA，Bax，Bcl-2(1∶200)抗體反應，4℃過夜后，加入辣根過氧化物酶連接的二抗 (1∶2000)反應約1.5 h，最后在暗室內進行檢測。用Image-Pro Plus 6.0凝膠圖像分析軟件對蛋白條帶進行灰度值掃描，以GAPDH為對照進行半定量分析。

2 結果

2.1 川芎嗪對結腸癌LoVo細胞的增殖的影響 用0.25～4.0 mg/mL梯度的川芎嗪處理LoVo細胞，觀察了川芎嗪對LoVo細胞增殖的影響。結果顯示，隨著川芎嗪質量濃度和作用時間的增加，川芎嗪對LoVo細胞的增殖抑制作用也逐漸加強 (見表1)。在川芎嗪為1.0、2.0、4.0 mg/mL 3個質量濃度點上作用24 h、48 h及48 h的結果與正常對照組比較均有統計學意義 (P＜0.05)，而各質量濃度川芎嗪對正常293T細胞的生長并沒有顯著性影響 (見表2)。

表1 川芎嗪對人結腸癌LoVo細胞增殖的影響 (，n=3)Tab.1 Effect of tetramethylpyrazine on the proliferation in human colon cancer LoVo cells(，n=3)

表1 川芎嗪對人結腸癌LoVo細胞增殖的影響 (，n=3)Tab.1 Effect of tetramethylpyrazine on the proliferation in human colon cancer LoVo cells(，n=3)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

24 h 48 h 72 h川芎嗪0 mg/mL組組別 OD 1.43±0.05 1.51±0.05 1.63±0.05川芎嗪0.25 mg/mL組 1.38±0.05 1.49±0.04 1.59±0.05川芎嗪0.5 mg/mL組 1.34±0.05 1.46±0.04 1.57±0.05川芎嗪1.0 mg/mL組 1.29±0.05*1.42±0.04* 1.47±0.04*川芎嗪2.0 mg/mL組 1.28±0.04*1.37±0.05* 1.43±0.06*川芎嗪 4.0 mg/mL組 1.25±0.04＊＊0.96±0.05＊＊1.19±0.04＊＊

表2 川芎嗪對人正常293T細胞增殖的影響 (，n=3)Tab.2 Effect of tetramethylpyrazine on the proliferation in human 293T cells(，n=3)

表2 川芎嗪對人正常293T細胞增殖的影響 (，n=3)Tab.2 Effect of tetramethylpyrazine on the proliferation in human 293T cells(，n=3)

注:與對照組比較，*P＜0.05

24 h 48 h 72 h川芎嗪0 mg/mL組組別 OD 1.42±0.06 1.47±0.04 1.50±0.056川芎嗪0.25 mg/mL組 1.41±0.06 1.45±0.04 1.49±0.063川芎嗪0.5 mg/mL組 1.41±0.06 1.46±0.06 1.46±0.042川芎嗪1.0 mg/mL組 1.41±0.05 1.45±0.08 1.47±0.021川芎嗪2.0 mg/mL組 1.38±0.07 1.39±0.07 1.45±0.052川芎嗪4.0 mg/mL組 1.28±0.05*1.43±0.07 1.46±0.018*

2.2 川芎嗪對結腸癌LoVo細胞凋亡的影響 用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，結果發現 (圖1)，與對照組 (凋亡率9.98%)比較，用1.0、2.0、4.0 mg/mL 3個不同質量濃度的川芎嗪處理LoVo細胞48 h后，其細胞凋亡率分別為32.32%、41.51%和49.94%，提示川芎嗪處理組細胞凋亡率呈劑量依賴性增加 (P＜0.01)。

圖1 川芎嗪誘導人結腸癌LoVo細胞凋亡Fig.1 Tetramethylpyrazine induces apoptosis in human colon cancer LoVo cells

2.3 川芎嗪對LoVo細胞中PUMA/Bax/Bcl-2 mRNA表達的影響 由圖2(RT-PCR檢測)結果表明，隨著川芎嗪質量濃度的增加，LoVo細胞的PUMA mRNA表達出現明顯上調，促凋亡基因Bax mRNA表達也出現上調，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達則呈現下調，與對照組相比均有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。

圖2 人結腸癌LoVo細胞中PUMA/Bax/Bcl-2的mRNA表達變化Fig.2 Changes of the expresion levels of PUMA/Bax/Bcl-2 mRNAs in human colon cancer LoVo cells

2.4 LoVo細胞中PUMA/Bax/Bcl-2蛋白表達水平 圖3的Western Blot結果顯示:隨著川芎嗪質量濃度的增加，人結腸癌LoVo細胞中PUMA蛋白表達呈明顯上調，促凋亡蛋白Bax蛋白表達也明顯上調，而抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達卻出現明顯的下調，與對照組相比均有顯著性差異 (P＜0.05或P ＜0.01)。

3 討論

結直腸癌通常由良性腺瘤逐步緩慢演變為惡性腺癌甚至遠處轉移，因此，篩查與早期診斷是防治結直腸癌的最佳手段。據流行病學資料顯示，我國已進入結腸癌高發區的行列。因此，我國對結腸癌防治研究的形勢緊迫，探討結直腸癌的發生發展機制，特別是從基因和人們的生活習慣兩個方面研究結直腸癌的發生的分子機制，對結直腸癌的防治將具有十分重要的理論和現實意義。

圖3 人結腸癌LoVo細胞中PUMA/Bax/Bcl-2蛋白的表達變化Fig.3 Changes of the expresion levels of PUMA/Bax/Bcl-2 proteins in human colon cancer LoVo cells

近年來報道川芎嗪具有抑制白血病［10］、乳腺癌［11］、宮頸癌［12］、前列腺癌［4］等多種惡性腫瘤的作用，川芎嗪的抗腫瘤作用日益受到人們重視，但它對結直腸癌的防治作用鮮見報道。在本實驗中觀察到不同質量濃度的鹽酸川芎嗪能有效地抑制Lo-Vo細胞增殖，增加其凋亡，且作用具有明顯時間和劑量依賴性。本實驗從細胞凋亡方向探討了川芎嗪的抗結直腸癌作用。結果證實:川芎嗪可以抑制人結腸癌LoVo細胞增殖，并可促進結腸癌LoVo細胞凋亡。以 PUMA、Bax、Bcl-2蛋白表達為代表，從線粒體凋亡途徑探討了川芎嗪誘導人結腸癌LoVo細胞凋亡的分子機制，結果提示川芎嗪可通過上調PUMA蛋白表達，進而上調Bax蛋白和下調Bcl-2蛋白表達，激活Caspase-3，促進腫瘤細胞凋亡，為川芎嗪用于防治人結腸癌提供了新的分子基礎和實驗依據。

關于川芎嗪抗腫瘤作用的分子機制，目前各種報道不一。有研究認為川芎嗪能下調VEGF的表達，進而抑制腫瘤的生長轉移［13］;也有人認為川芎嗪能降低腫瘤細胞DNA的合成，從而抑制細胞有絲分裂［14］，增強促凋亡基因的表達、抑制某些抗凋亡基因的表達。近期有研究發現AKT及其下游信號通路介導了川芎嗪抑制前列腺癌PC3細胞的增殖與促凋亡作用［4］，即川芎嗪可通過抑制AKT蛋白表達及活性，繼而抑制細胞增殖，啟動細胞凋亡，最終達到抑制前列腺癌PC3細胞生長的目標。

在中藥日益受到人們青睞的今天，已發現許多中藥有較好的抗腫瘤作用，其促凋亡的作用還與PUMA的表達密切相關［15］。本實驗結果證實，川芎嗪可通過上調PUMA蛋白表達，促進細胞凋亡。Wang等［15］用綠茶多酚處理腸癌細胞LoVo后，發現了同樣的作用。類似的報道還有大蒜素誘導腸癌LoVo細胞凋亡時PUMA表達增加，抑制PUMA表達，則大蒜素誘導細胞凋亡的作用明顯下降。次黃芩素作用于前列腺癌細胞LNCaP后，其胞內PUMA蛋白表達也增加，細胞色素C從線粒體內釋放增多，Caspases級聯反應被激活［16］。

Bcl-2蛋白是在細胞凋亡過程中起關鍵性作用的一類蛋白質。在線粒體膜上，Bcl-2家族蛋白通過與其他凋亡蛋白的協同作用，調控線粒體結構與功能的穩定性，發揮著細胞凋亡“主開關”的作用，Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax等，Bax蛋白在正常細胞中存在于細胞質中，當受到死亡信號刺激后，促凋亡蛋白產生增多，Bax與BID或BIM相互作用后形成插入線粒體膜的蛋白孔道，導致線粒體內細胞色素C釋放至胞質，在ATP或dATP作用下，與凋亡水解蛋白酶激活因子Apaf-1及胱天蛋白酶-9共同組成凋亡體，誘發細胞凋亡［17］。因此，Bcl-2家族促抗凋亡蛋白的平衡決定了細胞是否凋亡的命運，通過調節抗凋亡與促凋亡蛋白的平衡，調節細胞的存活。

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