糊精濕法制粒對淫羊藿總黃酮酶解的影響

高 霞，陳 彥*，王 瑩，周 靜

(1.南京中醫藥大學藥學院，江蘇南京 210023;2.江蘇省中醫藥研究院中藥新型給藥系統重點實驗室，國家中醫藥管理局中藥口服制劑釋藥系統重點研究室，江蘇南京 210028)

淫羊藿是傳統的補腎中藥，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的作用［1］。淫羊藿中黃酮成分是主要活性成分，主要有淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C等黃酮苷類［2］。現代藥理研究表明淫羊藿總黃酮具有很好的抗骨質疏松等作用［3-5］，但口服需經過腸道內酶和菌的酶解作用轉化成為次級苷才能夠很好地吸收發揮作用［6］。由于人體腸道內存在的水解酶 (腸道黏膜酶和腸道菌酶)因人種、年齡、飲食、藥物的影響而不同［7-9］，因此難以保證口服淫羊藿黃酮后能穩定快速的被水解吸收，并保持較好的抗骨質疏松等藥效。基于淫羊藿黃酮苷腸道酶解特點，課題組形成了構建外加水解酶、藥物、功能輔料三位一體的適宜于淫羊藿總黃酮腸道內“實時酶解”、“實時吸收”的仿生酶解口服給藥系統的研究思路。課題組在前期成功地在體外用蝸牛酶酶解淫羊藿總黃酮模擬其體內過程，本實驗將探討制劑成型過程中的制粒因素對淫羊藿總黃酮酶解可能產生的影響，為淫羊藿總黃酮仿生酶解口服給藥系統構建的可行性積累實驗數據。

1 儀器與材料

Agilent 1200型高效液相色譜儀 (DAD檢測器，四元泵，美國Agilent公司);數顯氣浴恒溫振蕩器 (金壇市雙捷實驗儀器廠);METTLER AL204十萬分之一天平 (瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);離心機 (長沙湘智離心機儀器有限公司)。

淫羊藿 (購自吉林敦化，經南京中醫藥大學吳德康教授鑒定為朝鮮淫羊藿);蝸牛酶 (上海源葉生物科技有限公司);淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和寶藿苷Ⅰ對照品 (上海源葉生物科技有限公司，純度＞98%)，淫羊藿苷元對照品 (自制，純度﹥98%);糊精 (國藥集團化學試劑有限公司，批號F20100816);乙腈為色譜純，水為高純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 淫羊藿總黃酮提取物的制備 稱取淫羊藿300 g，加15倍量50% 乙醇回流提取兩次，每次2 h，合并兩次濾液，回收乙醇［10］，真空干燥，得含4.44 g生藥/g的淫羊藿總黃酮粉末。

2.2 含酶淫羊藿總黃酮顆粒的制備 取蝸牛酶125 mg和糊精3 g混勻，再加入淫羊藿總黃酮粉末675 mg，混勻，加適量水制軟材，過20目篩制粒，低溫干燥，得含酶淫羊藿總黃酮顆粒。

2.3 淫羊藿總黃酮的體外酶解 取淫羊藿總黃酮粉末27 mg，加入10 mL pH 6.0的HBSS平衡鹽溶液中，放入37℃ 恒溫振蕩器中保溫。取蝸牛酶5 mg，用10 mL的pH 6.0的HBSS平衡鹽溶液溶解。將酶液加至等量的淫羊藿提取物溶液中，在37℃恒溫振蕩器中反應。另稱取含酶淫羊藿總黃酮顆粒152 mg，置于錐形瓶中，加入pH 6.0的HBSS緩沖溶液20 mL，放入37℃恒溫振蕩器中反應，分別在0、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6 h時取上述兩種反應液各150 μL，立即加300 μL乙醇終止反應，渦旋，離心后進HPLC儀分析測定，比較淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C及其酶解產物寶藿苷Ⅰ、箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ和淫羊藿苷元的量變化。實驗平行3次。

2.4 HPLC測定酶解液中6種主要黃酮成分的分析方法的建立

2.4.1 色譜條件 Zorbax SB C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈-水，梯度洗脫 (0～15 min，10% ～25% 乙腈;15～38 min，25% 乙腈;38～61 min，25% ～71% 乙腈;61～75 min，71% ～100% 乙腈);檢測波長270 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃。色譜圖見圖1。

圖1 對照品 (A)、酶解前樣品 (B)和酶解后樣品 (C)的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)，unenzymolysis sample(B)and enzymolysis sample(C)

2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取淫羊藿苷5.33 mg，朝藿定A 8.42 mg，朝藿定 B 9.05 mg，朝藿定C 8.26 mg，寶藿苷Ⅰ5.26 mg，淫羊藿苷元7.50 mg，加無水乙醇溶解稀釋至10 mL，作為貯備液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取轉化后的混懸液適量，立即加無水乙醇終止反應，渦旋，離心后即得。

2.4.4 標準曲線的繪制 精密量取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ和淫羊藿苷元貯備液適量，加無水乙醇稀釋成不同質量濃度的對照品溶液。所含朝藿定A分別為2.6、5.3、10.5、21.0、42.1、84.2、168.4 μg/mL，所含朝藿 定 B 分 別 為 1.4、2.8、5.7、11.3、22.6、45.2、90.5、181.0 μg/mL，所含朝藿定C分別為2.6、 5.2、 10.3、 20.6、 41.2、 82.6、 165.2 μg/mL，所含淫羊藿苷分別為 1.7、3.3、6.7、13.3、26.6、53.3、106.6 μg/mL，所含寶藿苷Ⅰ分 別 為 3.3、6.6、13.2、26.3、52.6、105.2 μg/mL，所含淫羊藿苷元分別為4.7、9.4、18.8、37.5、75.0、150.0 μg/mL。分別精密吸取各對照品溶液10 μL，進樣測定，記錄峰面積。以質量濃度 (x，μg/mL)為橫坐標，峰面積 (y)為縱坐標，進行線性回歸，得6種成分的回歸方程、相關系數和線性范圍。朝藿定A的線性回歸方程為y=17.443x+23.584，r=0.999;朝藿定B的線性回歸方程為y=27.196 x+21.610，r=0.999;朝藿定C的線性回歸方程為y=18.415x+19.589，r=1.000;淫羊藿苷的線性回歸方程為y=30.459x+24.061，r=0.999;寶藿苷Ⅰ的線性回歸方程為y=24.718x+23.400，r=0.999;淫羊藿苷元的線性回歸方程為y=6.895x－37.550，r=0.999。實驗結果表明朝藿定A在0.026～1.684 μg，朝藿定B在0.014～1.810 μg，朝藿定C在0.026～1.652 μg，淫羊藿苷在 0.017～1.066 μg，寶藿苷Ⅰ在0.033～1.052 μg，淫羊藿苷元在 0.0470 ～1.500 μg都呈良好的線性關系。

2.4.5 精密度試驗 精密吸取上述各對照品溶液10 μL，連續進樣 6次，測定峰面積，計算RSD值。結果，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ和淫羊藿苷元的RSD值分別是0.4%、1.0%、0.1%、0.8%、1.0%、1.5%。表明儀器的精密度良好。

2.4.6 穩定性試驗 取上述供試品溶液，室溫放置，分別于 0、1、2、4、8、12和 24 h進樣10 μL，測定各成分的峰面積，計算RSD值。結果朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ和淫羊藿苷元的RSD值分別是0.6%、1.4%、0.3%、0.8%、1.2%、1.8%。表明樣品溶液在24 h內穩定。

2.4.7 重復性試驗 平行制備6份供試品溶液，進樣10 μL，測定各成分的峰面積，計算RSD值，結果朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ和淫羊藿苷元的RSD值分別是0.6%、1.7%、0.2%、1.1%、1.5%、2.0%。表明樣品的重復性較好。

2.4.8 加樣回收率試驗 精密量取已知朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ和淫羊藿苷元質量濃度的供試品溶液6份，分別加入一定量的對照品，用無水乙醇稀釋至一定濃度并進樣10 μL，計算各對照品的平均加樣回收率和RSD值。結果朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ和淫羊藿苷元的平均回收率分別為100.0%、99.5%、99.6%、100.2%、99.6%、98.9%;RSD值分別為 0.6%、1.1%、1.2%、1.1%、1.3%、1.4%。

2.5 酶解結果比較

2.5.1 含酶淫羊藿總黃酮顆粒與未制粒的淫羊藿總黃酮中淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的酶解數據見圖2。淫羊藿總黃酮粉末與蝸牛酶不經制粒直接反應時，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C都在1 h左右基本酶解完全。經糊精濕法制粒得到的含酶淫羊藿總黃酮顆粒酶解時，淫羊藿苷、朝藿定A和朝藿定C在2 h時基本酶解完全，朝藿定B在3 h基本酶解完全，且三者的初始濃度都略低。實驗結果表明，經糊精濕法制粒后淫羊藿總黃酮酶解的速率變慢，這是由于淫羊藿總黃酮與蝸牛酶首先需要從顆粒中釋放才能反應，但在3 h內都能基本溶出并酶解，而人體腸道排空時間為4～6 h，因此糊精濕法制粒對含酶淫羊藿總黃酮顆粒中原型黃酮苷的消除影響不大。

圖2 糊精濕法制粒對淫羊藿苷與朝藿定A、B、C酶解的影響 (n=3)Fig.2 Enzymolysis changes of icariin，epimedin A，epimedin B ，and epimedin C by dextrin wet granulation(n=3)

2.5.2 淫羊藿總黃酮中淫羊藿苷的酶解產物寶藿苷Ⅰ及終產物淫羊藿苷元質量濃度的變化可知，寶藿苷Ⅰ是淫羊藿苷水解掉C 7位上的葡萄糖生成的次級苷［11］。酶解液中寶藿苷Ⅰ的質量濃度由兩方面決定，一方面淫羊藿苷水解生成寶藿苷Ⅰ，另一方面寶藿苷Ⅰ酶解成淫羊藿苷元。淫羊藿總黃酮粉末與蝸牛酶不經制粒直接反應時，寶藿苷Ⅰ的質量濃度在1 h時達到最高值21.87 μg/mL，之后質量濃度逐漸下降，說明它被繼續水解成了苷元，6 h時其質量濃度趨于穩定，此時寶藿苷Ⅰ的質量濃度僅有1.81 μg/mL，轉化了83.08%。含酶淫羊藿總黃酮顆粒酶解時，寶藿苷Ⅰ的質量濃度在3 h時達到最高值 24.35 μg/mL，之后質量濃度逐漸下降，6 h時寶藿苷Ⅰ的質量濃度為6.75 μg/mL，轉化了69.55%。實驗結果表明，經糊精濕法制粒后酶解產物寶藿苷Ⅰ的生成速率基本不變，但是水解速率顯著變慢，6 h時寶藿苷Ⅰ的質量濃度是未制粒淫羊藿總黃酮酶解時的3.7倍。因此，糊精濕法制粒可以提高酶解液中寶藿苷Ⅰ的量。

淫羊藿苷元是淫羊藿總黃酮水解掉所連接的糖基 (主要是C 3和C 7位上的糖)得到的終產物。淫羊藿總黃酮粉末與蝸牛酶不經制粒直接反應時，淫羊藿苷元的量隨酶解時間不斷增加，0～4 h基本成線性增加，生成速率約為8.12 μg/(mL·h)，6 h時淫羊藿苷元的質量濃度為30.35 μg/mL。含酶淫羊藿總黃酮顆粒酶解時，淫羊藿苷元的量隨酶解時間亦不斷增加，0～6 h基本成線性增加，生成速率約為3.43 μg/(mL·h)，6 h時淫羊藿苷元的質量濃度為19.43 μg/mL。與未制粒時相比較，其生成速率提高了2.4倍，6 h時的量提高了1.6倍。實驗結果表明，經糊精濕法制粒后酶解產物淫羊藿苷元的生成速率顯著變慢，酶解液中的質量濃度也較低。因此，糊精濕法制粒不利于淫羊藿苷元的生成，見圖3。

2.5.3 淫羊藿總黃酮中朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的酶解產物箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的量的變化見圖4。箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、寶藿苷Ⅰ分別是朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C水解掉C 7位上的葡萄糖生成的次級苷［11］。箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的單體成分較難獲得，因此以峰面積的大小來比較上述3種酶解產物在酶解過程中的變化。淫羊藿總黃酮粉末與蝸牛酶不經制粒直接反應時，箭藿苷A、箭藿苷B和鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的量在1 h左右達到最高，之后含有量逐漸下降，說明它們被繼續水解為其他物質，于6 h時箭藿苷A轉化了21.30%，鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ轉化了18.87%，而箭藿苷B基本不再水解。含酶淫羊藿總黃酮顆粒酶解時，箭藿苷A、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的量在2 h左右達到最高，箭藿苷B在3 h左右達到最高，且三者最終趨于穩定的量比未制粒淫羊藿總黃酮酶解時的都略高。實驗結果表明，經糊精濕法制粒后箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的生成速率略微變慢，但最終趨于穩定的量都略高。因此糊精濕法制粒有利于提高酶解液中次級苷箭藿苷A、箭藿苷B和鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的量。

圖3 糊精濕法制粒對酶解產物寶藿苷Ⅰ和淫羊藿苷元的影響 (n=3)Fig.3 Content changes of baohuosideⅠand icaritin by dextrin wet granulation(n=3)

圖4 糊精濕法制粒對酶解產物箭藿苷A、B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的影響 (n=3)Fig.4 Content changes of sagittatoside A，sagittatoside B，and 2″-O-rhamnosylicariside Ⅱby dextrin wet granulation(n=3)

3 討論

本實驗將蝸牛酶、淫羊藿總黃酮和糊精混合后制成含酶淫羊藿總黃酮顆粒，考查糊精濕法制粒對蝸牛酶仿生酶解淫羊藿總黃酮的影響。為模擬體內腸道情況，酶解溫度選擇了37℃，緩沖液選擇了pH 6.0的HBSS平衡鹽溶液。因為食物與藥物一般在人體腸道停留的時間為4～6 h［12］，所以僅考查了6 h內淫羊藿總黃酮的轉化情況。蝸牛酶與淫羊藿總黃酮經糊精濕法制粒后酶解，淫羊藿總黃酮中主要原型黃酮成分在3 h內都能完全被酶解，雖酶解速率變慢，但在腸道排空時間內都能溶出并被完全酶解;酶解產物的生成速率也變慢，但是6 h時酶解液中次級苷寶藿苷Ⅰ、箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的量都相對略高，但淫羊藿苷元的量相對較低，僅有未制粒直接酶解時的64.02%。所以糊精濕法制粒對淫羊藿總黃酮的酶解轉化有一定影響。

本實驗只是用糊精作為輔料簡單制粒，探索淫羊藿黃酮仿生酶解口服給藥系統構建的可行性，今后還可以采用多種功能輔料優化制劑成型過程，促進酶解，以提高制劑的生物利用度。此外，由于含酶淫羊藿總黃酮顆粒的酶解行為與未制粒粉末比較有一定差別，其藥效是否會有差別還有待進一步實驗考查。

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