LC-MS/MS同時測定四逆湯中11個有效成分

繆 萍，裘福榮，曾 金，李秋月，沈淑嬌，賀 敏，王猛猛，蔣 健(上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 201203)

四逆湯為東漢名醫張仲景之名方，始載于《傷寒論》，全方由生附子、干姜和炙甘草組成，具有回陽救逆之效，主治少陰病如四肢厥逆、下利清谷、嘔吐腹痛、苔白滑、脈沉遲或細微等癥。現代藥理研究證實，四逆湯具有強心、升壓、抗休克、抗心肌缺血、抗動脈粥樣硬化和提高免疫功能等作用［1-6］，且全方合用效果明顯優于各單味藥或任意兩兩組合，維持時間持久。烏頭類生物堿、姜酚、甘草皂苷和甘草黃酮是四逆湯中的主要有效成分［7］。烏頭類生物堿以C19雙酯型二萜類生物堿 (烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿)毒性最強，易導致嚴重的心律失常、呼吸抑制和休克。故臨床上使用附子需經過炮制，將劇毒性的雙酯型二萜生物堿水解為毒性較小的單酯型(苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿)及毒性更小的醇胺型 (烏頭原堿、新烏頭原堿和次烏頭原堿)生物堿［8］。姜酚是干姜的主要活性成分，具有強心、改善血液循環、降血脂和抗氧化的作用［9］。甘草主要含甘草酸、甘草次酸等三萜皂苷類以及甘草苷、甘草素等黃酮類成分，對心血管疾病有廣泛的治療作用［10］。而《中國藥典》2010年版一部僅以甘草酸作為四逆湯的成分定量測定標準［11］，未對其他活性成分進行監測。本研究建立了液相-質譜聯用 (LC-MS/MS)色譜法同時測定四逆湯中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿、次烏頭原堿、甘草苷、甘草酸和6-姜酚的量的方法，可為其質量控制研究提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ABI 4000Q-Trap質譜儀 (美國ABI/SCIEX公司)，配有電噴霧離子化源 (ESI)、三級四極桿質量分析器以及Analyst 1.4.2數據處理軟件;日本島津LC-20A超高速液相色譜儀;Beckman Allegra 64R高速冷凍離心機 (美國Beckman公司);XS-105電子天平 (瑞士Mettler Toledo公司);Millpore純水機 (美國Millipore公司);Thermo超低溫冰箱 (美國Thermo公司)。

1.2 試藥 生附子購自安徽亳州藥材公司，干姜和炙甘草均購自上海養和堂中藥飲片有限公司，經上海中醫藥大學中藥學院魏莉副研究員鑒定分別為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品，姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根莖及豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根莖。新烏頭堿 (批號110798-200805)、次烏頭堿 (批號110799-201106)和地西泮 (批號115-9302)均購自中國藥品生物制品檢定所;烏頭堿 (批號20120211)、苯甲酰烏頭原堿 (批號20130105)、苯甲酰新烏頭原堿 (批號20121210)、苯甲酰次烏頭原堿 (批號20121210)、烏頭原堿 (批號 20121210)和甘草酸 (批號20120910)均購自上海源葉生物科技有限公司;甘草苷 (批號ZL20120219GCG)和6-姜酚 (批號ZL20120422JF)均購自南京澤朗醫藥科技有限公司。次烏頭原堿 (批號MUST-13061403)購自成都曼斯特生物科技有限公司。除次烏頭原堿 (純度≥90%)外，其余對照品純度均≥98%。甲醇、乙腈 (色譜純)購自美國TEDIA公司;其他試劑均為分析純。水為去離子水。

2 方法與結果

2.1 液相條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動相 A為含4 mmol/L乙酸銨和0.08%甲酸水溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫 (0～1 min，40%B;1～4 min，40%B～90%B;4～9 min，90%B;9.5～16 min，40%B)。體積流量0.8 mL/min;進樣量10 μL;柱溫30℃。

2.2 質譜條件 電噴霧離子源 (ESI)，正離子掃描，離子源噴霧電壓 (IS)3000 V，離子化溫度(TEM)500℃，噴霧氣壓 (GS1)60 psi(1 psi=6.895 kPa)，輔助氣壓 (GS2)60 psi。多反應檢測(MRM)模式。11種被測成分的離子對、去簇電壓 (DP)、碰撞能量 (CE)和碰撞室射出電壓(CXP)見表1。

表1 四逆湯中11種指標成分的離子對和主要質譜參數Tab.1 Optimized structures parameters of eleven components in Sini Decoction

2.3 對照品溶液的制備 分別精密稱取烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿和次烏頭原堿適量，加入乙腈溶解并定容，搖勻，即得貯備液，－20℃冷藏備用。

精密稱取甘草苷、甘草酸和6-姜酚適量，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度作為標準貯備液，4℃冰箱保存。

用乙腈溶解地西泮，制成質量濃度為0.25 mg/mL的內標貯備液，并用乙腈稀釋至2.5 ng/mL。

2.4 四逆湯煎煮液的制備 依照《中國藥典》2010年版中四逆湯處方比例，取各味飲片 (生附子30 g，干姜20 g，炙甘草30 g)，加8倍量水，浸泡30 min，水沸后再煎30 min，趁熱過濾，藥渣加入6倍量水，同法煎煮30 min，合并兩次濾液，減壓濃縮至1 mL含0.2 g生藥。平行制備3個批次，批號分別為20130921、20130923、20130925。4℃冰箱冷藏備用。將制得的湯劑至離心機中10000 r/min離心 10 min。

各樣品進樣分析前，與2.5 ng/mL地西泮內標乙腈溶液按體積比1∶3渦旋混合30 s，離心(10000 r/min)10 min，0.45 μm 的微孔濾膜濾過，按“2.1”項和“2.2”項下條件分析。

2.5 陰性對照溶液的制備 按配伍劑量及供試品溶液制備方法制備同時不含生附子、干姜、炙甘草的陰性對照溶液。

2.6 專屬性 在該實驗條件下，分別精密吸取混合對照品溶液、四逆湯煎煮液及陰性對照溶液各10 μL進樣，結果顯示陰性對照溶液未檢測到干擾成分，按出峰順序11種成分烏頭原堿、次烏頭原堿、甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、甘草酸、烏頭堿、次烏頭堿、6-姜酚和內標 (地西泮)的保留時 間 分 別 為 1.57、1.59、1.75、2.17、2.53、2.81、 3.68、 3.90、 5.05、 5.27、 7.77、8.14 min。色譜圖見圖1。

2.7 標準曲線的制備 精密量取各對照品溶液適量，用乙腈稀釋成系列混合對照品溶液 (烏頭堿、新烏頭堿的質量濃度均為0.01、0.025、0.075、0.1、0.3、1、2.5 ng/mL;次烏頭堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿和次烏頭原堿的質量濃度均為0.1、0.25、0.75、1、3、10、25 ng/mL;苯甲酰烏頭原堿的質量濃度為 0.05、0.125、0.375、0.5、1.5、5、12.5 ng/mL;苯甲酰新烏頭原堿的質 量 濃 度 為 0.2、0.5、1.5、2、6、20、50 ng/mL;甘草苷的質量濃度為 6、15、45、60、180、600、1500 ng/mL;甘草酸的質量濃度為10、25、75、100、300、1000、2500 ng/mL;6-姜酚的質量濃度為 4、10、30、40、120、400、1000 ng/mL)，按“2.1”項和“2.2”項下條件分析，以對照品質量濃度 (X)為橫坐標，待測物峰面積As與內標峰面積Ais的比值 (Y)為縱坐標，作加權線性回歸計算，結果表明各成分在相應的線性范圍內線性關系良好 (見表2)。

圖1 11種混合對照品 (A)、四逆湯樣品溶液 (B)和陰性供試品溶液 (C)的LC-MS/MS色譜圖Fig.1 LC-MS/MS chromatograms of reference substances(A)，Sini Decoction(B)and negative samples(C)

表2 四逆湯中11種化學成分的線性回歸方程和相關系數Tab.2 Linear regression equations，correlation coefficients and quantitation limits of eleven components in Sini Decoction

2.8 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液 (含烏頭堿、新烏頭堿均為0.30 ng/mL，次烏頭堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿和次烏頭原堿均為3.0 ng/mL，苯甲酰烏頭原堿為1.5 ng/mL，苯甲酰新烏頭原堿為6.0 ng/mL，甘草苷180 ng/mL，甘草酸300 ng/mL，6-姜酚120 ng/mL)，按“2.1”項和“2.2”項下條件連續進樣5次，將峰面積比值代入當天標準曲線計算濃度，求得精密度，結果表明儀器精密度良好，烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿、新烏頭原堿、甘草苷、甘草酸和 6-姜酚的 RSD值分別為 2.1%、2.7%、2.8%、4.0%、3.5%、4.1%、3.3%、2.4%、4.0%、3.6%、1.7%。

2.9 重復性試驗 同一批四逆湯樣品，平行取樣6份，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項和“2.2”項下條件分析，測定各化合物的量，結果烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿、新烏頭原堿、甘草苷、甘草酸和6-姜酚的 RSD值分別為 1.9%、3.1%、2.8%、4.3%、5.5%、5.0%、3.3%、2.2%、3.0%、2.6%、1.4%，表明方法重復性良好。

2.10 穩定性試驗 取四逆湯同一供試品溶液在室溫下放置 0、2、4、8、12 h，按 “2.1”項和“2.2”項下條件分別進樣分析，根據標準曲線計算，結果烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿、新烏頭原堿、甘草苷、甘草酸和6-姜酚的RSD值分別為3.8%、2.2%、2.0%、4.0%、1.9%、1.8%、3.5%、2.0%、1.7%、0.92%、2.0%，表明樣品溶液在12 h內穩定。

2.11 回收率試驗 精密量取已知11種成分含有量的四逆湯水煎液，平行6份，分別加入上述混合對照品溶液適量 (每1 mL含烏頭堿1.25 ng、新烏頭堿3.12 ng、次烏頭堿46.1 ng、苯甲酰烏頭原堿14.9 ng、苯甲酰新烏頭原堿110 ng、苯甲酰次烏頭原堿52.4 ng、烏頭原堿3.32 ng、次烏頭原堿5.93 ng、甘草苷2501 ng、甘草酸4252 ng、6-姜酚755 ng)，按照“2.4”項下制備供試品溶液，依法測定，結果烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿、次烏頭原堿、甘草苷、甘草酸和6-姜酚的平均回收率為 103%、96.2%、101%、95.4%、 97.0%、 98.3%、 96.7%、 95.7%、99.4%、98.3%、100%，RSD分別為 2.1%、1.8%、1.3%、2.4%、3.5%、0.82%、1.5%、2.4%、2.7%、1.9%、2.3%，表明各成分加樣回收率良好。

2.12 樣品測定 精密吸取3個批次的四逆湯樣品，每批樣品平行測定 3次，按“2.1”項和“2.2”項下條件分析測定，以內標法計算各成分的量。結果見表3。

3 討論

四逆湯是一首組方簡單、療效確切的經典方，臨床應用廣泛。由于中藥復方是復雜體系，經多成分多途徑協同作用而發揮藥效，因此建立多組分同時定量的分析方法，對全面控制四逆湯的質量具有重要的意義。

表3 3個批次四逆湯中11種成分的測定結果(ng·mL －1，，n=3)Tab.3 Contents of eleven components in Sini Decoction(ng·mL－1，，n=3)

表3 3個批次四逆湯中11種成分的測定結果(ng·mL －1，，n=3)Tab.3 Contents of eleven components in Sini Decoction(ng·mL－1，，n=3)

頭原堿20130921 0.54±0.02 1.33±0.13 19.2±1.44 6.35批號 烏頭堿 新烏頭堿 次烏頭堿 苯甲酰烏±0.3620130923 0.62±0.01 1.42±0.09 18.0±1.32 5.72±0.2820130925 0.46±0.01 1.24±0.05 18.0±1.15 6.87±0.24批號 苯甲酰新烏頭原堿苯甲酰次烏頭原堿 烏頭原堿 次烏頭原堿20130921 45.0±2.54 21.8±0.87 1.33±0.09 2.41±0.2020130923 46.4±1.84 19.6±0.64 1.26±0.07 2.58±0.1620130925 48.4±1.95 20.4±1.05 1.21±0.06 2.64±0.14批號 甘草苷 甘草酸 6-姜酚20130921 1040±4.33 1742±5.26 320±3.2620130923 997±3.12 1800±5.55 324±2.2020130925 1024±3.56 1796±4.67 317±3.32

既往文獻對四逆湯的活性成分大多采用高效液相色譜法進行檢測，要求各種成分色譜峰完全分離，分析時間較長，多在30 min左右，并且最小檢測質量濃度均在5 μg/mL以上［12-15］。而串聯質譜法 (MS/MS)專屬性強，靈敏度高，不要求各種成分色譜峰完全分離，快速高效。實驗采用水提的方法對藥材進行處理，而未采用《中國藥典》中所述氨水潤濕后以異丙醇-二氯甲烷 (1∶1)混合液溶解提取的方法，主要是考慮到此方法只是單純的針對附子雙酯型生物堿而言，而本課題主要應用于四逆湯方劑研究，所以采用煎煮法，保證與傳統給藥方案的一致性。本實驗所建的色譜條件相對溫和，梯度洗脫，以乙腈-水為流動相，可以有效降低系統壓力。而且由于烏頭類生物堿具有弱堿性，所以在水相中加入4 mmol/L乙酸銨和0.08%甲酸，能夠明顯緩解烏頭堿的拖尾現象，實現對各個成分的分離。

本實驗采用LC-MS/MS法，對四逆湯中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿、次烏頭原堿、甘草苷、甘草酸和6-姜酚進行同時定量分析，范圍涵蓋方劑中全部藥味。該方法分離效果理想，精密度、重復性、穩定性、回收率均符合測定要求，耗時短，并且最低定量限為0.01 ng/mL，可用于活性成分含有量較低的相關研究，有利于進一步完善四逆湯的質量控制及相關研究。

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