HPLC法同時測定復方板藍根利咽顆粒中6種成分

羅友華，楊 輝*，林雪晶，黃愷飛，許光輝，黃亦琦

(1.廈門市醫(yī)藥研究所廈門市天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室，福建廈門 361008;2.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建福州 350122)

復方板藍根利咽顆粒是由板藍根、玄參、桔梗、甘草等六味中藥經(jīng)提取加工制成的復方制劑，具有清熱解毒、祛痰利咽的功效，用于咽喉腫痛、口咽干燥以及急、慢性咽喉炎和扁桃體炎見以上證候者的治療［1］。該制劑已獲福建省醫(yī)院制劑批準文號 (閩藥制字Z20120001)，臨床使用療效顯著。

該制劑中，以板藍根清熱解毒、涼血利咽為君藥，玄參清熱涼血、滋陰降火、解毒散結(jié)和桔梗宣肺利咽、祛痰排膿共為臣藥，甘草清熱解毒、祛痰止咳為佐使藥。該制劑質(zhì)量標準中僅采用了薄層層析定性鑒別，難以有效反映中藥復方制劑的質(zhì)量。因此，本實驗分別選擇板藍根、玄參、桔梗、甘草中的腺苷、(R，S)-告依春、哈巴俄苷、桔梗皂苷D、甘草苷和甘草酸銨等特征有效成分作為復方板藍根利咽顆粒水提液的指標成分，建立了HPLC法對其同時進行測定，旨在為及時檢測并全面跟蹤有效成分在復方板藍根利咽顆粒制備過程中各工序的轉(zhuǎn)移率提供一種高效方法，同時也為該中藥復方的質(zhì)量標準研究提供依據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀，包括低壓梯度四元泵，自動進樣器，恒溫箱，DAD紫外檢測器，Chem station色譜工作站 (美國 Agilent公司);XS205電子分析天平 (瑞士梅特勒-托利多公司，d=0.01mg)。

乙腈 (批號 12100484，色譜純，TEDIA公司)，甲醇 (批號12090074，色譜純，TEDIA公司)，磷酸 (批號20130104，分析純，遼寧嘉城精細化學品有限公司)，正丁醇 (批號20081024，廣東光華化學廠有限公司)，超純水 (自制)。

腺苷 (批號 110879-200202，純度 100%)、(R，S)-告 依 春 (批 號 111753-201103，純 度99.5%)、甘草苷 (批號 111610-201005，純度94.9%)、哈巴俄苷 (批號111730-201106，純度96.0%)、桔梗皂苷D(批號111851-201204，純度94.9%)、甘草酸銨 (批號110731-200614，純度100%)等對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。板藍根、玄參、桔梗、甘草等藥材均購自廈門燕來福制藥有限公司，經(jīng)本所楊輝副主任藥師鑒定均符合《中國藥典》2010年版要求。

2 方法

2.1 色譜條件 Agilent Zorbox Eclipse XDB-C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液 (B)，梯度洗脫 (0～10 min，3% ～10%A;10～14 min，10% ～18%A;14～22 min，18% ～24%A;22～30 min，24% ～27%A;30～34 min，27% ～28%A;34～35 min，28% ～33%A;35～40 min，33% ～50%A;40～45 min，50% ～80%A;45～47 min，80% ～100%A;47～48 min，100% ～3%A;48～50 min，3% ～3%A);檢測波長為260 nm(0～10 min)、245 nm(10～14 min)、278 nm(14～34.5 min)、210 nm(34.5～35.5 min)、250 nm(35.5～50 min);體積流量1mL/min;柱溫30℃;進樣量為 10 μL。

2.2 對照品溶液的配制 分別稱取腺苷2.76 mg、(R，S)-告依春2.56 mg、甘草苷3.84 mg、哈巴俄苷1.08 mg、桔梗皂苷 D 4.34 mg、甘草酸銨8.22 mg置于10 mL的量瓶中，加適量甲醇溶解后，用甲醇定容，搖勻即得混合對照品溶液，4℃冷藏備用。

2.3 供試品溶液的制備 按復方板藍根利咽顆粒處方，稱取板藍根15 g、玄參5 g、桔梗5 g、甘草2 g等，按復方板藍根利咽顆粒最佳提取工藝 (加8倍藥材量的水，微沸提取3次，每次1 h，過濾后合并濾液即得)得復方板藍根利咽顆粒水提液，并濃縮成110 mL，加入甲醇110 mL，搖勻，離心10 min(1200 r/min)，精密量取上清液20 mL，置水浴上蒸干，殘渣加20 mL水溶解，用水飽和正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，將正丁醇液蒸干，殘渣加適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移并定容至5 mL的量瓶中，搖勻，0.45 μm濾膜濾過即得。

2.4 陰性供試品溶液的制備 按復方板藍根利咽顆粒處方，分別稱取缺板藍根、缺玄參、缺桔梗、缺甘草的復方藥材，按“2.3”項下方法分別制備缺板藍根、缺玄參、缺桔梗、缺甘草的陰性供試品溶液，4℃冷藏備用。

3 結(jié)果

3.1 方法專屬性試驗 在“2.1”項色譜條件下，所測6種有效成分與其他成分色譜峰均可基線分離(分離度大于1.5)，且陰性供試品無干擾。對照品、供試品及陰性供試品色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

3.2 線性關(guān)系的考察 精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液67、100、200、500、1000、1667、3333、5000 μL分別置5 mL的量瓶中，加甲醇定容后搖勻，得系列混合對照品溶液。按“2.1”項色譜條件紀錄色譜圖及峰面積。以峰面積y為縱坐標，質(zhì)量濃度x(mg/mL)為橫坐標，得回歸方程:腺苷y=12325x+24.11，r=0.9996;(R，S)-告依春y=67935x+154.08，r=0.9991;甘草苷y=15633x+48.40，r=0.9992;哈巴俄苷y=27735x+25.78，r=0.9991;桔梗皂苷 D y=1558.5 x+14.66，r=0.9991;甘草酸銨y=7283.5x+52.84，r=0.9991。腺苷、(R，S)-告依春、甘草苷、哈巴俄苷、桔梗皂苷D和甘草酸銨分別在 0.0037～0.2760、0.0034～0.2547、0.0049～0.3644、0.0014～0.1037、0.0055～0.4119和0.0110～0.8220 mg/mL范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

3.3 精密度試驗 取混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，腺苷、(R，S)-告依春、甘草苷、哈巴俄苷、桔梗皂苷D和甘草酸銨峰面積的 RSD值分別為1.0%、1.0%、1.0%、1.0%、1.0%和1.0%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

3.4 重復性試驗 取同一批號藥材，按“2.3”項下方法制備供試品溶液5份，分別按“2.1”項下色譜條件測定。腺苷、(R，S)-告依春、甘草苷、哈巴俄苷、桔梗皂苷D和甘草酸銨峰面積的RSD值分別為0.9%、0.8%、0.1%、1.0%、1.7%、0.1%。結(jié)果表明，方法重復性良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗 取同一批號 (批號20130401)供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別在0、2、4、8、12 h測定。腺苷、(R，S)-告依春、甘草苷、哈巴俄苷、桔梗皂苷D和甘草酸銨峰面積的RSD值分別為 1.4%、0.7%、0.4%、0.2%、1.8%和0.2%。結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.6 加樣回收率試驗 精密量取5000 μL已知含有量的復方板藍根利咽顆粒水提液濃縮液 (批號20130301，各成分質(zhì)量濃度分別為:腺苷0.0624 mg/mL，(R，S)-告依春 0.0450 mg/mL，甘草苷0.0888 mg/mL，哈巴俄苷0.0227 mg/mL，桔梗皂D 0.0553 mg/mL，甘草酸銨0.1083 mg/mL)5份，分別精密加入已知質(zhì)量濃度的混合對照品溶液［腺苷 0.0610 mg/mL，(R，S)-告依春 0.0421 mg/mL，甘草苷0.0844 mg/mL，哈巴俄苷0.0243 mg/mL，桔梗皂苷 D 0.0560 mg/mL，甘草酸銨0.1043 mg/mL］ 5000 μL，加入甲醇 10 mL，搖勻，離心10 min(1200 r/min)，小心取出上清液，置水浴上蒸干，殘渣加20 mL水溶解，用水飽和正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，將正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移并定容至5 mL量瓶中，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過，然后按“2.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

3.7 樣品測定 取3批藥材，按“2.3”項下方法提取制備，進行測定，結(jié)果見表2。

4 討論

4.1 現(xiàn)代研究表明，板藍根主要含有生物堿類、有機酸類、多糖類、氨基酸類、核苷類等，其中腺苷等核苷類和表告依春等生物堿類均是其抗病毒的重要有效成分［2-4］;玄參主要含環(huán)烯醚萜類、苯丙素苷類，其中哈巴俄苷為玄參特征性有效成分，具有抗炎等作用［5-7］;桔梗主要有效成分為三萜皂苷類，桔梗皂苷D是其主要皂苷，具有祛痰作用［8］;甘草主要活性成分為甘草苷等甘草黃酮類和甘草酸等甘草皂苷類，具有抗炎、抗病毒、祛痰等活性［9］。這6種有效成分與復方板藍根利咽顆粒的功效主治密切相關(guān)，故選擇這6種成分進行測定。

4.2 在190～400 nm間分別對腺苷、(R，S)-告依春、甘草苷、哈巴俄苷、桔梗皂苷D和甘草酸銨溶液做紫外掃描，發(fā)現(xiàn)其分別在260、245、278、278、210、250 nm處有最大吸收，結(jié)合《中國藥典》2010年版相關(guān)藥材項下成分測定方法，根據(jù)這6種成分的保留時間，最終確定檢測波長切換時間順序為260 nm(0～10 min)、245 nm(10～14 min)、278 nm(14～34.5 min)、210 nm(34.5～35.5 min)、250 nm(35.5～50 min)。

4.3 在預試驗中考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液等流動相，最終選擇乙腈-0.05%磷酸水溶液為流動相，按本實驗梯度洗脫程序，結(jié)果除桔梗皂苷D的色譜峰未基線分開外，其余各有效成分色譜峰均較好分開，保留時間也適中。又因桔梗皂苷D的響應(yīng)值較低，易受其他雜質(zhì)影響。所以，對復方板藍根利咽顆粒水提液按“2.3”項下方法進行前處理，最終使桔梗皂苷D分離良好。

表1 加樣回收率實驗(n=6)Tab.1 Results of recovery tests(n=6)

表2 樣品測定結(jié)果(n=3)Tab.2 Results of content determination of samples(n=3)

4.4 中藥成分的多樣性、復雜性和作用機制的模糊性使中藥質(zhì)量控制仍存在許多問題，是中藥現(xiàn)代化的瓶頸之一，中藥的整體作用及多成分、多靶點的特點，決定了任何一個單一成分作為指標都不能準確反映中藥復方制劑的質(zhì)量［10］。應(yīng)用現(xiàn)代分析技術(shù)實現(xiàn)中藥復方有效成分群的多指標成分檢測，是中藥質(zhì)量控制的發(fā)展趨勢［11-15］。因此，本實驗建立的同時測定復方板藍根利咽顆粒水提液中6種有效成分的HPLC法，為其今后生產(chǎn)質(zhì)量控制研究提供了依據(jù)。

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