HPLC梯度洗脫法同時測定克痛酊中的去氫二異丁香酚、五味子甲素、α-香附酮和木犀草素

何曉梅

(西北民族大學醫學院，甘肅蘭州 730030)

克痛酊為中藥復方制劑，處方來源于衛生部藥品標準中藥成方制劑第十五冊，由黑老虎根、香附、廣藿香、豆豉姜、香加皮、花椒、九里香、雞骨香、石菖蒲、高良姜、莪術、三棱、細辛、兩面針、雙眼龍、降香、黃芩、梔子、樟腦、薄荷腦二十味藥物組成。具有祛風去濕、活血止痛之功效，可用于肚痛、跌打腫痛、風濕骨痛等癥的治療［1-2］。原部頒標準中未對方中的任何成分進行定量測定，不能有效地控制產品的質量和療效，本實驗采用高效液相梯度洗脫法對黑老虎根［3］中去氫二異丁香酚、五味子甲素和香附中α-香附酮、木犀草素進行定量測定方法研究，為完善該制劑質量標準提供依據。

1 試藥與儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀;G1322A脫氣機、G1311A四元泵、G1329A自動進樣器、Chemstation色譜工作站;G1315B可變波長檢測器;五味子甲素對照品 (批號為110764-201111，純度以99.5%計)、α-香附酮對照品 (批號為110748-201111，純度以99.3%計)、去氫二異丁香酚對照品 (批號為111838-201102，純度以99.4%計)和木犀草素對照品 (批號為111520-200504，用前置五氧化二磷干燥器減壓干燥12 h)來源于中國食品藥品檢定研究院;藥材均購于甘肅省民安中藥飲片有限公司，各藥材按國家質量標準項下檢驗均符合要求;克痛酊 (每瓶裝15 mL，批號為131010、131016、131027)購于廣東一力羅定制藥有限公司;磷酸 (分析純，廣州化學試劑二廠);甲醇 (色譜純，天津市康科德科技有限公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 依利特Hypersil C18色譜柱(4.6 mm ×200 mm，5 μm);體積 流量 0.9 mL/min;流動相A為甲醇，流動相B為0.2%磷酸溶液［4-5］，梯度洗脫 (0～11 min，75.0%A;12～26 min，75.0% →60.0%A;27～50 min，60.0%A);檢測波長 (0～26min，λ1=254 nm［6-7］;27 ～ 36 min，λ2=270 nm;37 ～ 50 min，λ3=350 nm［8-11］);體積流量 0.9 mL/min。此系統條件下所測組分與其他組分分離效果良好，理論塔板數按五味子甲素、α-香附酮、去氫二異丁香酚和木犀草素計均不低于2000，分離度均大于2。

原題：The 2011 MW9.0Tohoku earthquake：Comparison of GPS and strong－motion data

2.2 樣品制備

我國公路建設項目引發的水土流失主要為：破壞原有生態環境，擾動和破壞地表。據統計，“十二五”期間，公路建設直接或間接破壞地表總面積為119.6萬公頃。由于公路建設所經區域的地貌類型復雜多樣，因此公路工程建設過程中不同地貌類型的水土流失程度也不盡相同。

2.2.3 陰性對照試驗 按克痛酊處方比例稱取除黑老虎根的其余藥味和除香附的其余藥味各一份，按克痛酊的生產工藝分別制成缺黑老虎根的陰性樣品和缺香附的陰性樣品，按照上述供試品溶液的配制方法制成缺黑老虎根的陰性對照溶液和缺香附的陰性對照溶液。分別精密吸取10 μL供試品溶液、混合對照品溶液、缺黑老虎根的陰性對照溶液及缺香附的陰性對照溶液，按上述方法測定，結果在與五味子甲素、α-香附酮、去氫二異丁香酚和木犀草素對照品色譜圖相應的保留時間處，供試品溶液色譜圖中有吸收峰，而陰性對照色譜圖中未顯吸收峰，色譜圖見圖1。

2.3.3 重復性試驗 稱取同一批樣品6份，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，依法進樣測定，計算，求得各組分RSD分別為0.8%(五味子甲素)、0.4%(α-香附酮)、0.5%(去氫二異丁香酚)和0.6%(木犀草素)。結果表明，本法測定重復性良好。

2.2.1 混合對照品溶液的制備 取五味子甲素、α-香附酮、去氫二異丁香酚和木犀草素對照品各適量，精密稱定，分別加80%甲醇制成混合對照品溶液 (五味子甲素為0.0106 mg/mL，α-香附酮為0.0074 mg/mL，去氫二異丁香酚為 0.0218 mg/mL，木犀草素為0.0032 mg/mL)。

2.3 方法學考察

2.3.2 精密度試驗 取“2.2.1”項下的混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件重復進樣6次，測定，記錄五味子甲素、α-香附酮、去氫二異丁香酚和木犀草素的峰面積，RSD分別為0.4%(五味子甲素)、0.3%(α-香附酮)、0.8%(去氫二異丁香酚)和0.6%(木犀草素)。結果表明，儀器具有良好精密度。

黏土的作用比較復雜，它表現在以下4個方面：陽離子交換量高產生附加導電性使電阻率降低［2］；伊利石和蒙脫石本身具有很強的吸水性，使束縛水飽和度增加，電阻率降低；黏土的填隙式和襯膜式分布造成微孔隙發育使束縛水飽和度增大，電阻率降低［3］；泥質含量增加也可導致電阻率降低。

2.3.1 線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取上述溶液和對照品溶液各20 μL，注入色譜儀中，按上述色譜條件進行測定，以峰面積Y與進樣量X進行線性回歸處理，得回歸方程為:五味子甲素Y=2.0342×106X －265.3，r=0.9995;α-香附酮 Y=1.1362×106X+289.5，r=0.9997;去氫二異丁香酚Y=2.5702×106X+533.1，r=0.9994;木犀草素 Y=1.1689×106X－433.8，r=0.9996。五味子甲素、α-香附酮、去氫二異丁香酚和木犀草素分別在 0.0106～0.2120、0.0074～0.1480、0.0218～0.4360、0.0032～0.0640 μg范圍內進樣量與峰面積線性關系良好。

寶玉爹如此一說，倒把喜姑的臉說紅了。她略帶嬌嗔地說，人家這不是想向你老人家拜師學藝嘛！接著又說，我聽人說，你演《黃鶴樓》里的劉備，臉上可以表演一邊笑，一邊驚慌，是真的嗎？

在高額利潤下，銀行業員工的收入水平也遠遠高于其他行業工作人員 。據公開數據顯示，多數上市銀行員工2012年上半年人均收入都在10萬元以上，居各行業之首。在中國的實體經濟發展遭遇困難的情況下，這樣的差距自然引發人們普遍質疑。而銀行與公眾是一場有輸有贏的“零和游戲”。當然，在這場“零和游戲”中，銀行肯定是贏家，而且贏得很大，而公眾永遠是輸家，而且輸得不明不白，這勢必會導致公眾的不滿。

2.2.2 供試品溶液的配制 精密量取本品10 mL，置50 mL具塞錐形瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液作為供試品溶液。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.3.4 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，在室溫下放置0、1、2、4、6、8 h后，每次進樣10 μL，測定其峰面積值，求得各組分RSD分別為0.6%(五味子甲素)、0.8%(α-香附酮)、0.3%(去氫二異丁香酚)和0.7%(木犀草素)。結果表明，供試品溶液8 h內基本穩定。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密量取已知含有量的同一批克痛酊 (批號 131010，五味子甲素為0.054 mg/mL，α-香附酮為0.036 mg/mL，去氫二異丁香酚為0.112 mg/mL，木犀草素為 0.018 mg/mL)5 mL，置50 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入混合對照品溶液25 mL、用80%甲醇稀釋至刻度，按“2.2.2”項下供試品溶液的配制方法制備加樣供試品試液。按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算各組分回收率，結果見表1。

2.4 樣品測定 取3個批號的樣品，按“2.2.2”項下供試品制備方法，按“2.1”項下色譜條件測定，結果見表2。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 取五味子甲素、α-香附酮、去氫二異丁香酚和木犀草素對照品各適量，分別加80%甲醇溶解制成每1 mL含0.02 mg的溶液，在200～400 nm波長處進行紫外掃描，結果五味子甲素和α-香附酮對照品溶液均在254 nm處有最大吸收，去氫二異丁香酚對照品溶液在270 nm處有最大吸收，木犀草素對照品溶液在350 nm處有最大吸收。故選擇254 nm作為五味子甲素和α-香附酮的測定波長，270 nm作為去氫二異丁香酚的測定波長，350 nm作為木犀草素的測定波長。

表1 五味子甲素、α-香附酮、去氫二異丁香酚和木犀草素回收率試驗結果Tab.1 Results of recovery test for deoxyschizandrin，αcyperone，dehydrodiisoeugenol and luteolin

表2 樣品測定結果 (，n=3)Tab.2 Results of content determination(，n=3)

表2 樣品測定結果 (，n=3)Tab.2 Results of content determination(，n=3)

批 號 五味子甲素/(mg·mL －1)α-香附酮/(mg·mL －1)去氫二異丁香酚/(mg·mL －1)木犀草素/(mg·mL －1)1310100.054±0.0010.036±0.0010.112±0.0020.018±0.0011310160.060±0.0010.040±0.0010.122±0.0020.021±0.0011310270.056±0.0010.033±0.0010.109±0.0020.019±0.001

3.2 流動相的選擇 本實驗中曾分別采用乙腈-水［10］、甲醇-0.4% 磷酸［4-5，12］和甲醇-0.2% 磷酸溶液為流動相不同比例進行梯度洗脫，結果以乙腈-水不同比例梯度洗脫時五味子甲素峰型良好，但其他3個組分達不到基線分離;以甲醇-0.4%磷酸不同比例梯度洗脫時木犀草素、五味子甲素和去氫二異丁香酚均能達到基線分離，而α-香附酮峰型較差，有拖尾現象;以甲醇-0.2%磷酸溶液為流動相不同比例進行梯度洗脫時，所測各組分分離效果良好，分離度均大于2。

［1］國家藥典委員會.國家藥品標準中藥成方制劑:第十五冊［S］.北京:人民衛生出版社，1998:89.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:241-242，附錄30，附錄36.

［3］王 楠，李占林，劉曉秋，等.黑老虎根化學成分的研究(Ⅱ)［J］.中國藥物化學雜志，2012，22(4):305-309.

［4］袁春玲，王佩琪，郭偉英.HPLC法同時測定婦可靖膠囊中木犀草素和芍藥苷的含量［J］.中國藥房，2012，23(3):263-265.

［5］王國英，薛培鳳，布 仁，等.HPLC法測定蒙藥藍盆花中木犀草素和芹菜素的含量［J］.中國藥房，2012，23(15):1407-1409.

［6］呂 霞，茍瓊心，李陳波，等.HPLC法測定七制香附丸中 α-香附酮的含量［J］.中國藥房，2011，22(16):1507-1508.

［7］李 姣，常增榮，傅欣彤.璇機化積膏質量標準研究［J］.中成藥，2012，34(8):1615-1618.

［8］王艷艷，張 杰，侯依珊，等.忍冬葉中木犀草素及木犀草苷含量的動態變化［J］.中國醫藥工業雜志，2013，44(6):568-570.

［9］吳金爽，吳德玲，俞年軍，等.RP-HPLC法同時測定亳菊總黃酮中3種黃酮類成分［J］.中成藥，2013，35(4):774-776.

［10］黃曉文，王李平，范華均，等.開奶茶顆粒劑質量標準的試驗研究［J］.中成藥，2012，34(10):1933-1938.

［11］張林林，王永吉，李 航，等.UFLC法同時測定護肝膠囊中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素［J］.中成藥，2013，35(1):96-99.

［12］常 秋，蔣華軍，羅敏燕，等.不同地區香薷各部位總黃酮及游離黃酮的分析研究［J］.中成藥，2013，35(3):580-584.