HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定調(diào)更湯中3個(gè)活性成分

侯劍偉，丁 越，張 彤*，徐蓮薇

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032)

調(diào)更湯主要由白芍、地黃、首烏藤、淫羊藿等藥味組成。在臨床上用于治療圍絕經(jīng)期綜合征，改善烘熱汗出、情志異常、失眠等癥狀，效果良好［1］。方中淫羊藿溫陽(yáng)，白芍?jǐn)筷帲诪跆傥陡市云剑茌^好地調(diào)節(jié)植物神經(jīng)。整方調(diào)節(jié)患者臟腑陰陽(yáng)失衡，改善患者腎陰虛、肝血不足的現(xiàn)象［2］。為了更好控制調(diào)更湯質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)建立了一種同時(shí)測(cè)定調(diào)更湯中白芍有效成分芍藥苷［3-4］、首烏藤有效成分 2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷［5］、淫羊藿主要成分淫羊藿苷的高效液相色譜法［6］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀 (Agilent-1100型，包括G1315A二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó) Agilent公司)，Chemstations色譜工作站 (美國(guó) Agilent公司)，AG285電子天平 (0.01 mg，瑞士METTLER公司)。

1.2 試藥 芍藥苷 (批號(hào)20110926)、淫羊藿苷(批號(hào)20111123)、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷 (批號(hào)20120415)對(duì)照品均購(gòu)自上海源葉生物技術(shù)有限公司，純度均大于98%。調(diào)更湯 (上海中醫(yī)藥大學(xué)制，批號(hào)分別為20120721、20120722、 20120723、 20130422、 20130424、20130425)。甲醇、乙腈均為色譜純，水為重蒸水，其他所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Kromasil-C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相 A為蒸餾水，B為乙腈，梯度洗脫 (0～10 min，15%B;10～30 min，15% ～25%B;30～40 min，25% ～50%B);柱溫30℃;體積流量1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)芍藥苷230 nm，2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷320 nm，淫羊藿苷270 nm;進(jìn)樣量為20 μL。在上述條件下，樣品中各對(duì)照品與其他組分達(dá)到基線分離，與相鄰的色譜峰分離度大于1.5。各對(duì)照品峰理論塔板數(shù)不小于3000。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取干燥至恒重的對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成1 mL含芍藥苷、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、淫羊藿苷分別為0.193 mg/mL、0.204 mg/mL、0.353 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密量取調(diào)更湯樣品1 mL，置10 mL量瓶中蒸餾水定容，吸取上清液，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)即可。

2.4 方法學(xué)研究

2.4.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版，設(shè)定230 nm(芍藥苷)、270 nm(淫羊藿苷)、320 nm(2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷)。

圖1 對(duì)照品 (A)與不同波長(zhǎng)下調(diào)更湯樣品 (B～D)HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)，Tiaogeng Decoction samples in differen wavelengths(B-D)

2.4.2 線性關(guān)系考察 以混合對(duì)照品溶液為母液，對(duì)半稀釋?zhuān)謩e配制成一系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。分別吸取上述的對(duì)照品溶液各20 μL，進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度 (μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回歸方程Tab.1 Regression equation

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取高中低3個(gè)質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，依“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定。按峰面積計(jì)算RSD值。其中芍藥苷高中低3個(gè)質(zhì)量濃度的RSD分別為0.12%、0.62%、1.3%。2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷高中低3個(gè)質(zhì)量濃度的RSD分別為1.7%、1.0%、0.41%。淫羊藿苷高中低3個(gè)質(zhì)量濃度的 RSD分別為0.46%、0.26%、0.81%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)20120723樣品，按“2.3”項(xiàng)供試品液制備方法制備，于0、3、6、12、24 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。芍藥苷、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、淫羊藿苷3個(gè)化合物峰面積RSD分別為2.5%、2.6%和1.4%。結(jié)果表明，在24 h內(nèi)供試品溶液基本穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)20120723樣品，按“2.3”項(xiàng)制備供試品液6份，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算。結(jié)果樣品中芍藥苷、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、淫羊藿苷分別為1.125、0.1764、0.7560 mg/mL。RSD分別為1.8%、2.7%、1.7%。表明方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密移取調(diào)更湯水煎液(批號(hào)20120723)0.5 mL 9份，每3份為一組，按高中低 (即80%、100%、120%)比例精密加入一定量的對(duì)照品貯備液，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定樣品，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 樣品測(cè)定 取6批調(diào)更湯樣品 (批號(hào)20120721、 20120722、 20120723、 20130422、20130424、20130425)。每批各 6份。按 “2.3”項(xiàng)方法制備各樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以每1 mL含芍藥苷、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、淫羊藿苷分別為0.193、0.204、0.353、0.0121、0.0137、0.0221 mg/mL的高低兩種混合對(duì)照品溶液，按外標(biāo)兩點(diǎn)法以峰面積計(jì)算樣品中3種成分量。結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)Tab.2 Results of recovery tests(n=9)

3 討論

3.1 采用HPLC法測(cè)定了調(diào)更湯水煎劑中有效成分的量。參考相關(guān)文獻(xiàn)［7-15］，對(duì)乙腈-水，甲醇-磷酸水及乙腈-磷酸水流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行了考察，最終采用乙腈-水系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，能同時(shí)測(cè)定其中芍藥苷、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、淫羊藿苷3種成分的量，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)便快速，精密度、重復(fù)性、回收率良好，可作為調(diào)更湯的質(zhì)量控制方法。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果 (n=6)Tab.3 Contents of three constituents in Tiaogeng Decoction(n=6)

3.2 本實(shí)驗(yàn)所用的色譜條件可使調(diào)更湯中的各主要色譜峰得到良好的分離，分析結(jié)果表明，經(jīng)Chemstations色譜工作站峰純度光譜檢驗(yàn)，各主要成分色譜峰純度均大于95%。

3.3 中藥復(fù)方湯劑是中醫(yī)臨床的主要用藥方式，除方劑配伍外，其療效還受飲片質(zhì)量及湯劑制備方法的影響。本實(shí)驗(yàn)建立的質(zhì)量控制方法，為調(diào)更湯的實(shí)驗(yàn)及臨床療效研究打下基礎(chǔ)。

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