HPLC-DAD法同時測定調更湯中3個活性成分

侯劍偉，丁 越，張 彤*，徐蓮薇

(1.上海中醫藥大學，上海 201203;2.上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 200032)

調更湯主要由白芍、地黃、首烏藤、淫羊藿等藥味組成。在臨床上用于治療圍絕經期綜合征，改善烘熱汗出、情志異常、失眠等癥狀，效果良好［1］。方中淫羊藿溫陽，白芍斂陰，首烏藤味甘性平，能較好地調節植物神經。整方調節患者臟腑陰陽失衡，改善患者腎陰虛、肝血不足的現象［2］。為了更好控制調更湯質量，本實驗建立了一種同時測定調更湯中白芍有效成分芍藥苷［3-4］、首烏藤有效成分 2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷［5］、淫羊藿主要成分淫羊藿苷的高效液相色譜法［6］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀 (Agilent-1100型，包括G1315A二極管陣列檢測器，美國 Agilent公司)，Chemstations色譜工作站 (美國 Agilent公司)，AG285電子天平 (0.01 mg，瑞士METTLER公司)。

1.2 試藥 芍藥苷 (批號20110926)、淫羊藿苷(批號20111123)、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷 (批號20120415)對照品均購自上海源葉生物技術有限公司，純度均大于98%。調更湯 (上海中醫藥大學制，批號分別為20120721、20120722、 20120723、 20130422、 20130424、20130425)。甲醇、乙腈均為色譜純，水為重蒸水，其他所用試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Kromasil-C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相 A為蒸餾水，B為乙腈，梯度洗脫 (0～10 min，15%B;10～30 min，15% ～25%B;30～40 min，25% ～50%B);柱溫30℃;體積流量1 mL/min;檢測波長芍藥苷230 nm，2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷320 nm，淫羊藿苷270 nm;進樣量為20 μL。在上述條件下，樣品中各對照品與其他組分達到基線分離，與相鄰的色譜峰分離度大于1.5。各對照品峰理論塔板數不小于3000。結果見圖1。

2.2 混合對照品溶液的制備 取干燥至恒重的對照品適量，精密稱定，加甲醇制成1 mL含芍藥苷、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、淫羊藿苷分別為0.193 mg/mL、0.204 mg/mL、0.353 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密量取調更湯樣品1 mL，置10 mL量瓶中蒸餾水定容，吸取上清液，0.45 μm微孔濾膜濾過即可。

2.4 方法學研究

2.4.1 測定波長的選擇 根據《中國藥典》2010年版，設定230 nm(芍藥苷)、270 nm(淫羊藿苷)、320 nm(2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷)。

圖1 對照品 (A)與不同波長下調更湯樣品 (B～D)HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)，Tiaogeng Decoction samples in differen wavelengths(B-D)

2.4.2 線性關系考察 以混合對照品溶液為母液，對半稀釋，分別配制成一系列質量濃度的對照品溶液。分別吸取上述的對照品溶液各20 μL，進樣測定。以峰面積為縱坐標，質量濃度 (μg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線，計算得回歸方程，結果見表1。

表1 回歸方程Tab.1 Regression equation

2.4.3 精密度試驗 精密吸取高中低3個質量濃度的混合對照品溶液20 μL，重復進樣5次，依“2.1”項色譜條件測定。按峰面積計算RSD值。其中芍藥苷高中低3個質量濃度的RSD分別為0.12%、0.62%、1.3%。2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷高中低3個質量濃度的RSD分別為1.7%、1.0%、0.41%。淫羊藿苷高中低3個質量濃度的 RSD分別為0.46%、0.26%、0.81%。結果表明，儀器精密度良好。

2.4.4 穩定性試驗 取批號20120723樣品，按“2.3”項供試品液制備方法制備，于0、3、6、12、24 h按“2.1”項下色譜條件測定。芍藥苷、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、淫羊藿苷3個化合物峰面積RSD分別為2.5%、2.6%和1.4%。結果表明，在24 h內供試品溶液基本穩定。

2.4.5 重復性試驗 取批號20120723樣品，按“2.3”項制備供試品液6份，按“2.1”項色譜條件測定，記錄峰面積，計算。結果樣品中芍藥苷、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、淫羊藿苷分別為1.125、0.1764、0.7560 mg/mL。RSD分別為1.8%、2.7%、1.7%。表明方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 精密移取調更湯水煎液(批號20120723)0.5 mL 9份，每3份為一組，按高中低 (即80%、100%、120%)比例精密加入一定量的對照品貯備液，按“2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件測定樣品，計算回收率，結果見表2。

2.5 樣品測定 取6批調更湯樣品 (批號20120721、 20120722、 20120723、 20130422、20130424、20130425)。每批各 6份。按 “2.3”項方法制備各樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定。以每1 mL含芍藥苷、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、淫羊藿苷分別為0.193、0.204、0.353、0.0121、0.0137、0.0221 mg/mL的高低兩種混合對照品溶液，按外標兩點法以峰面積計算樣品中3種成分量。結果見表3。

表2 加樣回收率試驗結果 (n=9)Tab.2 Results of recovery tests(n=9)

3 討論

3.1 采用HPLC法測定了調更湯水煎劑中有效成分的量。參考相關文獻［7-15］，對乙腈-水，甲醇-磷酸水及乙腈-磷酸水流動相系統進行了考察，最終采用乙腈-水系統進行梯度洗脫，能同時測定其中芍藥苷、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、淫羊藿苷3種成分的量，并進行了方法學考察，結果表明該方法簡便快速，精密度、重復性、回收率良好，可作為調更湯的質量控制方法。

表3 樣品測定結果 (n=6)Tab.3 Contents of three constituents in Tiaogeng Decoction(n=6)

3.2 本實驗所用的色譜條件可使調更湯中的各主要色譜峰得到良好的分離，分析結果表明，經Chemstations色譜工作站峰純度光譜檢驗，各主要成分色譜峰純度均大于95%。

3.3 中藥復方湯劑是中醫臨床的主要用藥方式，除方劑配伍外，其療效還受飲片質量及湯劑制備方法的影響。本實驗建立的質量控制方法，為調更湯的實驗及臨床療效研究打下基礎。

［1］桑 珍，徐蓮薇.中藥調更湯改善圍絕經期綜合征患者陰陽失衡狀態89例臨床觀察［J］江蘇中醫藥，2006，27(7):36-37.

［2］徐蓮薇，張淑君，孫卓君.圍絕經期綜合征病因病機特點的思考［J］.中醫雜志，2008，49(11):1031-1033.

［3］任劍江，陳斌龍，俞旭平，等.不同白芍藥材中芍藥苷含量比較研究［J］.中國現代中藥，2010，12(7):22-24.

［4］王久富，謝英新.HPLC法同時測定四物合劑中芍藥內酯苷和芍藥苷的含量［J］.黑龍江醫藥，2006，19(5):347-348.

［5］劉善新，劉 青，孫 建，等.高效液相色譜法測定市售首烏藤中 2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量［J］.時珍國醫國藥，2007，18(9):2196-2197.

［6］張華峰，高 翔，盧大炎，等.HPLC法同時測定淫羊藿中朝藿定A、B、C與淫羊藿苷的含量［J］.分析測試學報，2007，26(2):198-201.

［7］成旭東，孫 蕓，劉 揚.高效液相色譜法測定首烏丸中2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量［J］.中國藥物警戒，2012，9(1):1-3.

［8］楊 青，郭炎榮.RP-HPLC同時測定心腦康膠囊中葛根素和2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量［J］.中國藥師，2009，12(6):730-731.

［9］劉 峽，王曉瓊，邱海蘊，等.RP-HPLC法測定生白飲中淫羊藿苷的含量［J］.中國藥事，2012，26(11):1241-1242，1245.

［10］張琳琳，祁 峰，卞海林.HPLC法測定通氣合劑中芍藥苷和橙皮苷的含量［J］.現代中西醫結合雜志，2012，21(36):4092-4093.

［11］盧 佶，吳 君.高效液相色譜法測定養血調經膠囊中芍藥苷的含量［J］.海峽藥學，2012，24(10):83-84.

［12］李 娟，趙 迪，周悌強，等.HPLC法同時測定補肺益腎顆粒中淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷［J］.中成藥，2012，34(12):2335-2339.

［13］陶 松，劉 玲，劉旭海，等.補腎口服液中淫羊藿苷含量的HPLC測定方法研究［J］.江西中醫學院學報，2012，24(3):48-50.

［14］孔 銘，朱玲英，王佩娟，等.HPLC測定補腎活血顆粒中芍藥苷，阿魏酸，淫羊藿苷的含量［J］.中成藥，2010，32(4)600-603.

［15］謝曉梅，何常明，陳家寬，等.HPLC測定柴芍雙仙膠囊中芍藥苷和淫羊藿苷含量［J］.中國中藥雜志，2005，30(15):1210-1211.