RP-HPLC法測定5種劑型的九味羌活制劑中紫花前胡苷、異歐前胡素

張幸福，范瑩瑩，王 菲，楊鳳梅，駱桂法，劉海青

(青海省食品藥品檢驗所，青海西寧 810016)

九味羌活方出自金代名醫張元素，后元代醫家王好古師從張元素之徒李杲學醫，首次將九味羌活湯錄于《此事難知》一書中［1］。具解表散寒，祛風除濕之功效［2］，為風寒感冒的首選良藥。經現代制藥技術制成九味羌活丸 (大蜜丸、小蜜丸、濃縮丸、水丸)和九味羌活顆粒［3-4］，在2009年收入國家基本藥物目錄。該系列制劑處方相同，由羌活、防風、蒼術、黃芩、川芎、地黃、細辛、白芷和甘草等九味中藥材組成。方中羌活、白芷均含有紫花前胡苷和異歐前胡素，為兩味藥材的主要成分［5-7］和活性成分［8-10］，查閱文獻尚無該系列制劑中紫花前胡苷的測定方法［11-14］。本實驗應用高效液相色譜梯度洗脫，對九味羌活5種劑型的紫花前胡苷和異歐前胡素進行了定量測定，方法涵蓋市售的九味羌活系列的全部品種，可以為九味羌活制劑的質量控制提供參考。

1 儀器與材料

島津LC-20ATVP型高效液相色譜儀，Sartrious BT224S電子天平 (德國 Sartrious公司)，Ohaus AR5120電子天平 (奧豪斯公司)，Hangping FA1004電子天平 (上海天平儀器廠)，超聲波清洗器 (KQ5200B，功率200 W，頻率40kHz，昆山市超聲儀器有限公司)。

紫花前胡苷、異歐前胡素 (供含量測定用，批號111821-201001、110827-201008，均購自中國食品藥品檢定研究院)。液相用甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純 (市售)，水為超純水。九味羌活系列制劑樣品來自生產企業、經營單位及使用單位，包括大蜜丸、小蜜丸、濃縮丸、水丸和顆粒劑共5種劑型24批次。

2 方法與結果

2.1 色譜條件［13-16］Diamonsil C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相A相為乙腈，B相為0.5% 冰乙酸水溶液，梯度洗脫 (0～35 min，10%→50%A;35～50 min，50%A→55A%;50～60 min，55%→80%A);柱溫30℃;體積流量1.0 mL/min;檢測波長330 nm;進樣量10 μL;記錄時間60 min。理論塔板數按異歐前胡素峰計算不低于2000。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取紫花前胡苷0.01173 g置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得紫花前胡苷對照品貯備液。精密稱取異歐前胡素對照品0.01053 g(純度99.4%)置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得異歐前胡素對照品貯備液。精密量取紫花前胡苷貯備液5.0 mL，異歐前胡素貯備液1.0 mL置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得 (每1 mL含紫花前胡苷23.46 μg、異歐前胡素8.37 μg)。

2.3 供試品溶液的制備 取各九味羌活制劑，研細混勻 (大蜜丸剪成細小碎粒)，取1 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，超聲30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 專屬性試驗 根據九味羌活制劑的處方，取除去羌活和白芷的樣品，照“2.3”項方法制備陰性供試品溶液。按“2.1”項色譜條件，分別精密吸取對照品溶液、陰性樣品溶液、供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，測定，即得。供試品色譜中，在與紫花前胡苷、異歐前胡素對照品色譜峰相應的位置上，有保留時間相同的色譜峰，陰性無干擾，見圖1。

圖1 九味羌活制劑的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of Jiuwei Qianghuo preparations

2.5 線性關系考察 精密量取紫花前胡苷對照品貯備液 (0.2346 mg/mL)20 mL，置50 mL量瓶中，甲醇定容搖勻 (93.84 μg/mL)，取異歐前胡素貯備液 (41.87 μg/mL)適量，逐步稀釋成含紫花前胡苷質量濃度為 0.938、2.815、7.507、18.768、37.536、46.920 μg/mL，異歐前胡素質量濃 度 為 1.256、2.512、4.187、8.374、12.561、16.748 μg/mL的混合對照品溶液，分別精密吸取10 μL，按“2.1”項條件，注入色譜儀測定，以進樣量 (ng)為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸處理，得紫花前胡苷回歸方程為Y=2.659×103X －2.539×103，r=0.9999;異歐前胡素回歸方程為 Y=1.660×103X－38，r=0.9999，紫花前胡苷在9.38～469.20 ng、異歐前胡素在12.56～167.48 ng范圍內線性關系良好。

2.6 定量限和檢出限 檢出限是指從背景干擾中區分出被測物的最低質量濃度。進1針甲醇，測出噪音的峰高，取紫花前胡苷和異歐前胡素對照品溶液，用甲醇逐級稀釋進樣測出峰高，按3倍和10倍信噪比計算出紫花前胡苷和異歐前胡素的檢出限分別為0.28、1.34 μg/mL，定量限分別為0.75、2.51 μg/mL。

2.7 穩定性試驗 取九味羌活水丸，按選定方法制備供試品溶液，室溫下保存，分別于配置后0、3、5、10、18、49 h進樣，按“2.1”項條件，注入液相色譜儀，測定并記錄色譜圖，考察其穩定性。紫花前胡苷峰面積的RSD為0.7%，異歐前胡素峰面積的RSD為0.6%。

2.8 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液，連續進樣5次，每次10 μL，測定紫花前胡苷峰面積的RSD為1.5%、異歐前胡素峰面積的RSD為1.2%，表明精密度好。

2.9 重復性試驗 取同一批次九味羌活制劑樣品，平行6份，取約1 g，精密稱定，照“2.3”項方法制成供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣測定。結果紫花前胡苷的RSD為1.6%，異歐前胡素的RSD為1.7%。

2.10 回收率試驗 采用加樣回收法，取已知含有量的九味羌活水丸 (紫花前胡苷為1.2549 mg/g、異歐前胡素為0.4753 mg/g)約0.5 g，平行6份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入紫花前胡苷 (15.26 μg/mL)、異歐前胡素對照品溶液(5.024 μg/mL)50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。按上述測定方法進行測定，計算回收率，結果見表1。

表1 回收率考察結果Tab.1 Results of recovery tests

2.11 樣品測定 取九味羌活制劑樣品，照“2.3”項方法制成供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣測定，計算紫花前胡苷、異歐前胡素的量。測定結果見表2。

表2 樣品測定結果Tab.2 Determination results of samples

3 討論

3.1 黃芩、羌活、川芎、白芷、蒼術和地黃等六味藥材的特征峰在此色譜系統中均能體現，因此該系統分析時間較長。由于處方藥材多，成分復雜，本實驗只選取紫花前胡苷和異歐前胡素進行定量測定，嘗試用甲醇-0.1% 磷酸溶液、乙腈-0.5%冰乙酸溶液等多種流動相，最后選擇甲醇-0.1%冰乙酸為流動相梯度洗脫，在該條件下被測組分的峰形和分離度良好。本實驗共測定不同生產企業的水丸11批，濃縮丸2批，大蜜丸4批，小蜜丸2批，顆粒劑5批，并以紫花前胡苷和異歐前胡素的總量來分析比較。

3.2 白芷的主要藥效成分為揮發性成分，揮發性成分在放置過程中極易損失。紫花前胡苷和異歐前胡素的總量在大蜜丸、小蜜丸、濃縮丸中相對穩定。在水丸中二者總量差異明顯，既表現在同一企業內，也表現在不同企業間。而在顆粒劑中的單獨含有量及總量均較低。

3.3 水丸和蜜丸均為藥材細粉用水泛丸或加煉蜜制丸;顆粒劑和濃縮丸中羌活、防風、蒼術、細辛、川芎提取揮發油，白芷進行滲漉 (顆粒劑)或部分原粉 (濃縮丸)。同為噴入揮發油，濃縮丸中紫花前胡苷和異歐前胡素的量遠遠高于顆粒劑。據文獻報道，歐前胡素長時間受熱會損失高達40%［17］。曲永勝［18］認為揮發油是否影響九味羌活顆粒的療效，需要進一步更深入的研究。目前對藥物中揮發油的穩定性研究以 β-環糊精包合為主［19-21］。

［1］俞長榮.試論張元素的學術成就［J］.中醫雜志，1962(5):38-41.

［2］張 彬，李玉璽.九味羌活丸的功效［J］.中成藥研究，1982(9):45.

［3］國家藥品監督管理局.國家中成藥標準匯編:內科肺系(一)分冊［S］.2002:143-147.

［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:448-450.

［5］楊秀偉，顧哲明.羌活化學成分的研究［J］.中草藥，1993，24(10):507-511.

［6］王夢月，賈敏如.白芷的化學成分研究進展［J］.中藥材，2002，25(6):446-449.

［7］Qiao Shanyi，Yao Xinshen，Wang Zhiyue.Counmarins of the roots of Angelica dahurica ［J］.Planta Med，1996，62(6):584.

［8］李云霞，高春華，沙 明.中藥羌活化學成分及藥理作用研究進展［J］.遼寧中醫藥大學學報，2004，6(1):22-23.

［9］吳亦琴，陳明明，趙宗惠，等.中藥羌活的研究進展［J］.檢驗醫學教育，2005，12(1):33-35.

［10］劉 元，李星宇，宋志釗，等.白花前胡丙素和紫花前胡苷祛痰作用研究［J］.時珍國醫國藥，2009，20(5):1049.

［11］宋九華，王 剛，劉素君.HPLC測定九味羌活丸中黃芩苷、甘草酸和異甘草素含量［J］.中成藥，2010，32(11):1914-1916.

［12］秦春梅，劉友平，鄢 丹，等.九味羌活丸 (濃縮丸)質量標準研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2003，9(5):1-3.

［13］趙渤年，丁曉彥，劉 青.HPLC法測定九味羌活丸中異歐前胡素的含量［J］.山東醫藥，2008，48(26):94-95.

［14］趙渤年，劉 青，丁曉彥.HPLC法測定九味羌活顆粒中歐前胡素的含量［J］.藥物分析雜志，2007，27(12):1967-1968.

［15］黃育生，袁賢琳，鐘 瑜，等.HPLC法測定羌活中紫花前胡苷的含量［J］.中國民族民間醫藥.2013(10):14-15.

［16］陳 燕，易進海，劉云華等.中藥羌活質量標準研究［J］.藥物分析雜志，2010，30(5):945-949.

［17］劉 萍.HPLC法測定白芷提取揮發油前后歐前胡素含量［J］.實用中醫藥雜志，2004，20(8):470-470.

［18］曲永勝.不同工藝對九味羌活顆粒中歐前胡素及異歐前胡素含量的影響［J］.齊魯藥事，2009，28(11):692-694.

［19］高 燕，趙渤年，丁曉彥.多指標正交實驗法研制九味羌活揮發油β-環糊精包合物［J］.時珍國醫國藥，2007，18(8):1901-1902.

［20］唐富麗，秦郁文.九味羌活顆粒揮發油β-環糊精包合工藝研究［J］.中國藥師，2011，14(7):987-989.

［21］孫娟娟，解成喜.新疆圓柏實揮發油的β-環糊精包合工藝研究［J］.中成藥，2013，35(1):185-187.