川貝母藥材生物堿成分HPLC-ELSD特征圖譜的研究

雷艷輝，李會軍，李 萍

(中國藥科大學天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇南京 210009)

川貝母基原復雜，《中國藥典》2010年版規定了百合科貝母屬6種基原植物，即川貝母Fritillaria cirrhosa D.Don、暗紫貝母F.unibracteata Hsiao et K.C.Hsia、甘肅貝母 F.przewalskii Maxim.、梭砂貝母F.delavayi Franch、太白貝母F.taipaiensis P.Y.Li或瓦布貝母F.unibracteata Hsiao et K.C.Hsia var.wabuensis(S.Y.Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu，S.Wang et S.C.Chen［1］。由于這些基原植物分布區域重疊，種間變異復雜且外形相似，導致市場上川貝母藥材往往基原混雜。因此，如何準確鑒別基原對于確保川貝母藥材質量具有重要意義。

中藥特征圖譜是指某些藥材、提取物或制劑經過適當處理后，采用一定的分析手段對其所含化學成分進行表征，得到的能夠標示其化學特征的色譜或光譜圖。由于色譜分析兼具分離、鑒別以及定量測定的能力，所得到的色譜圖中各色譜峰蘊含有出峰順序、保留時間、峰高、峰面積等信息，因此可以作為綜合的量化色譜鑒別方法。中藥特征圖譜是中藥整體性的化學表征，與采用單一化學對照品作對照的鑒別方法相比，具有更好的專屬性［2］，已廣泛應用于各種中藥材和成方制劑的質量控制［3-10］。在《中國藥典》2010年版中，有7種植物油脂和中藥提取物的質量標準中應用了特征圖譜鑒別方法。此外，《美國藥典》、《歐洲藥典》、《香港中藥材標準》等均收載有植物藥/中藥特征圖譜鑒別方法。

川貝母主含各類甾體生物堿［11］，本實驗采用HPLC-ELSD方法，建立了針對川貝母所含甾體生物堿的特征圖譜，以期對川貝母的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent1100 Series高效液相色譜儀 (美國Agilent公司);Alltech2000蒸發光散射檢測器(ELSD);Milli-Q純水儀 (美國 Millipore公司);KH-500DB型數控超聲波清洗器 (昆山禾創超聲儀器有限公司);BT25S電子天平 (Sartorius);Heraeus PICO17離心機 (德國 Thermo公司);Oasis MCX 3 cc固相萃取小柱 (美國Waters公司)。

色譜純乙腈 (德國Merck公司)，色譜純甲醇(江蘇漢邦科技有限公司)，其余試劑均為分析純，超純水 (18 MΩ·cm－1)由Milli-Q純水儀制，西貝母堿、貝母辛、貝母素甲和貝母素乙對照品(實驗室自制，HPLC測定純度達98.5%以上)。

川貝母藥材信息見表1，經中國藥科大學天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室李萍教授鑒定，憑證標本存放于中國藥科大學生藥學教研室。

表1 川貝母藥材來源Tab.1 Sources of Fritillariae cirrhosae Bulbus

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent Zorbax Extend-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為乙腈 (A)-0.1%甲酸 (10 mmol/L甲酸銨，pH=4)(B)，梯度洗脫 (0～15 min，85% ～75%B;15～23 min，75%B;23～35 min，75% ～55%B;35～40 min，55%～0% B);柱溫25℃;體積流量0.8 mL/min;進樣體積20 μL;ELSD漂移管溫度108℃;載氣體積流量2.8 L/min。

2.2 混合對照品溶液的制備 取西貝母堿、貝母辛、貝母素甲和貝母素乙對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含西貝母堿0.3 mg、貝母辛0.2 mg、貝母素甲0.3 mg和貝母素乙0.2 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取樣品粉末 (過60目篩)約3 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，加5 mL濃氨水密閉浸潤1 h，然后加入60 mL二氯甲烷-甲醇 (4∶1)混合溶劑超聲處理1 h，濾過，濾渣用20 mL混合溶劑洗滌，合并濾液與洗液，蒸干，殘渣用0.1 mol/L鹽酸溶解，準備進行混合型陽離子交換 (MCX)固相萃取。先以3 mL甲醇活化，而后加3 mL水平衡MCX小柱;將0.1 mol/L HCl溶液溶解的樣品轉移至已活化的MCX小柱內;用3 mL 0.1 mol/L HCl及3 mL甲醇依次洗滌小柱除雜;用2 mL 10% 二乙胺甲醇溶液洗脫樣品，洗脫液經氮氣吹干后以1 mL甲醇渦旋復溶，離心取上清液即得。

2.4 方法學考察 以太白貝母 (TB-1)為實驗材料進行方法學考察。

2.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液，按“2.1”項下方法連續進樣6次，記錄色譜圖，以貝母辛為參照峰，計算特征峰的相對保留時間。結果各特征峰相對保留時間的RSD值均小于0.4%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取同一批樣品 (TB-1)，按“2.3”項下方法平行制備供試品溶液6份，分別進樣，記錄色譜圖，以貝母辛為參照峰，計算特征峰的相對保留時間。結果各特征峰的相對保留時間的RSD值均小于0.3%，表明該方法重復性良好。

2.4.3 耐用性考察

2.4.3.1 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進行測定，記錄色譜圖，以貝母辛為參照峰，計算特征峰的相對保留時間。結果各特征峰相對保留時間的RSD值均小于0.5%，說明樣品溶液在24 h內穩定。

2.4.3.2 不同體積流量的考察 考察了不同體積流量 (0.8 mL/min、1 mL/min)對相對保留時間的影響。結果各特征峰分離程度無明顯變化且相對保留時間的RSD值均小于1.9%，表明體積流量對相對保留時間的影響在可接受范圍內。

2.4.3.3 不同柱溫的考察 考察了不同柱溫(25℃、30℃、35℃)對相對保留時間的影響。結果各特征峰分離程度無明顯變化且相對保留時間的RSD值均小于1.0%，表明柱溫對相對保留時間的影響在可接受范圍內。

2.4.3.4 不同色譜柱的考察 考察了不同色譜柱Agilent Hypersil BDS-C18(4.0 mm ×250 mm，5 μm)、Kromasil 100-5C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)、Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)對相對保留時間的影響。結果各特征峰分離程度無明顯變化且相對保留時間的RSD值均小于4.5%，表明色譜柱型號對相對保留時間的影響在可接受范圍內。

2.4.3.5 不同儀器的考察 考察了不同儀器 (Agilent1100高效液相色譜儀、島津LC-20AB高效液相色譜儀)對相對保留時間的影響。結果在這兩種不同儀器上，各特征峰分離程度無明顯變化且相對保留時間的RSD值均小于3.0%，表明不同儀器對相對保留時間的影響在可接受范圍內。

2.5 川貝母特征圖譜的建立 按“2.1”項下色譜條件對6批太白貝母樣品進行檢測，采用國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版”對所得HPLC色譜圖進行匹配，時間窗0.50，采用中位數法生成太白貝母特征圖譜匹配圖，見圖1，其中R為對照特征圖譜。太白貝母特征圖譜中標定了8個共有特征峰，其中4、5、6號峰分別是貝母辛、貝母素甲和貝母素乙。以貝母辛為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間 (表2)。

圖1 太白貝母HPLC特征圖譜匹配圖Fig.1 HPLC-specific chromatograms of bulbs of Fritillaria taipaiensis

表2 太白貝母HPLC特征圖譜共有峰的相對保留時間Tab.2 Relative retention time of common peaks of HPLC-specific chromatograms of bulbs of Fritillaria taipaiensis

采用同樣方法分別生成暗紫貝母、甘肅貝母、瓦布貝母的特征圖譜匹配圖 (圖2～4)。暗紫貝母特征圖譜中標定了4個共有特征峰，其中2號峰為貝母辛;甘肅貝母特征圖譜中標定了7個共有特征峰，其中4號峰為貝母辛;瓦布貝母特征圖譜中標定了8個共有特征峰，其中2、3、4、5號峰分別是西貝母堿、貝母辛、貝母素甲和貝母素乙。限于篇幅，暗紫貝母、甘肅貝母和瓦布貝母特征圖譜共有峰的相對保留時間從略。

7批川貝母和7批梭砂貝母各批次間化學成分差異較大，無法建立特征圖譜 (其HPLC重疊圖分別見圖5、圖6)。

圖2 暗紫貝母HPLC特征圖譜匹配圖Fig.2 HPLC-specific chromatograms of bulbs of Fritillaria unibracteata

3 討論

3.1 色譜條件及樣品溶液制備 生物堿類成分在色譜柱上易與反相填料的硅醇基發生反應而拖尾，為了改善樣品的色譜分離行為，參照文獻 ［12］的色譜條件，在0.1%甲酸溶液中加入10 mmol/L的甲酸銨，調pH為4后，發現生物堿類成分的色譜行為得到明顯改善。

圖3 甘肅貝母HPLC特征圖譜匹配圖Fig.3 HPLC-specific chromatograms of bulbs of Fritillaria przewalskii

圖4 瓦布貝母HPLC特征圖譜匹配圖Fig.4 HPLC-specific chromatograms of bulbs of Fritillaria wabuensis

圖5 川貝母HPLC重疊圖Fig.5 Overlap of HPLC chromatograms for bulbs of Fritillaria cirrhosa

圖6 梭砂貝母HPLC重疊圖Fig.6 Overlap of HPLC chromatograms for bulbs of Friiillaria delavayi

未經前處理的藥材樣品色譜圖較為復雜，經LC-MS鑒定后發現除了生物堿類成分外，還有一些非生物堿類成分，增加了譜圖的復雜性。為了富集生物堿類成分，本實驗使用混合型陽離子交換(Mixed-mode cationic-exchange，MCX)固相萃取小柱進行樣品前處理。MCX固相萃取柱添加混合型陽離子交換反相吸附劑，具有離子交換色譜和反相色譜的雙重保留模式，對堿性化合物具有高選擇性和高靈敏度，適合用于貝母樣品中生物堿的富集純化。

3.2 特征圖譜的比較 36批川貝母藥材中，太白貝母、暗紫貝母、甘肅貝母、瓦布貝母各批次藥材化學組成相對穩定，可以建立基于共有峰模式的特征圖譜;而川貝母和梭砂貝母各批次樣品化學組成差異較大，無法建立特征圖譜。由圖1～4可知，雖然太白貝母、暗紫貝母、甘肅貝母、瓦布貝母中均含有貝母辛，但整體化學成分表現出顯著差異，可以通過特征圖譜進行鑒別。

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