藍(lán)紅膠囊中三七的質(zhì)量控制方法

花曉薇，李 巖，程雪梅，楊 華，胡高云，王長虹*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室中藥新資源與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)綜合評價國家中醫(yī)藥管理局重點研究室上海市復(fù)方中藥重點實驗室，上海 201210;2.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室，新疆烏魯木齊 830011;3.湖南漢森醫(yī)藥研究有限公司，湖南長沙 413000;4.中南大學(xué)藥學(xué)院，湖南長沙 413000)

藍(lán)紅膠囊由藍(lán)刺頭、杜仲、紅花、三七和珍珠等五味藥材組成，是在蒙古族民間治療骨傷科疾病傳統(tǒng)驗方的基礎(chǔ)上開發(fā)的新制劑。該藥具有活血散瘀、消腫止痛、續(xù)筋接骨的作用，用于軟組織挫傷、關(guān)節(jié)扭傷，外傷和手術(shù)所致的開放性創(chuàng)傷，肢體骨折等病癥［1］。為了對藍(lán)紅膠囊進(jìn)行質(zhì)量控制，本實驗對制劑中三七的質(zhì)量控制方法進(jìn)行了研究，建立了三七的薄層鑒別方法，并用HPLC-ELSD法對藍(lán)紅膠囊中三七皂苷 R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd進(jìn)行定量測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Linomat-Ⅵ薄層色譜自動點樣器 (瑞士CAMAG公司)，Reprostar 3薄層色譜攝像儀(瑞士CAMAG公司)，AE200電子分析天平 (Mettler)，KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)。Agilent1100高效液相色譜儀 (安捷倫公司)，Alltech ELSD 2000ES蒸發(fā)光散射檢測儀 (美國奧泰科技有限公司)，HWS12型電熱恒溫水浴鍋，Microfuge 18臺式微量離心機(jī) (美國貝克曼公司)。

1.2 試藥 三七皂苷R1(純度大于98%)、人參皂苷 Rg1(純度 96.3%)、人參皂苷 Re(純度89.1%)、人參皂苷Rb1(純度92.9%)、人參皂苷Rd(純度94.4%)，三七對照藥材，以上對照品均由中國藥品生物制品檢定研究院提供;乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。硅膠HSGF254預(yù)制板 (煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司);自制藍(lán)紅膠囊，批號分別為20120710、20120720、20121012、20121013、20121014、 20121112;通遼市綠茵蒙醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司提供藍(lán)紅膠囊，批號20041225。陰性對照樣品按處方除去被測藥材，其余藥味按藍(lán)紅膠囊生產(chǎn)工藝制備，即得。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別試驗 取本品1 g，研細(xì)，加水5滴，攪勻，再加以水飽和的正丁醇5 mL，密塞，振搖約10 min，放置2 h，離心，取上清液，加3倍量以正丁醇飽和的水，搖勻，放置使分層，取正丁醇層，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

另分別取缺三七的混合藥材粉末樣品1 g，同法制成陰性對照溶液。取三七對照藥材0.3 g，同法制成對照藥材溶液。另分別取人參皂苷Rb1、Rg1、Rd對照品及三七皂苷R1對照品，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版附錄ⅥB)試驗［2］，吸取上述溶液各3 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-乙酸乙酯-水 (4∶1∶5)上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以硫酸溶液 (1→10)，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品、對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，見圖1。在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂與實際質(zhì)量控制中，可以采用對照藥材法對藍(lán)紅膠囊中的三七藥材進(jìn)行定性鑒別。

圖1 藍(lán)紅膠囊三七薄層色譜圖 (黃海HSGF254板)Fig.1 TLC chromatogram of Notoginseng Radix in Lanhong Capsules

2.2 樣品中成分測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱Venusil XBP C18柱;流動相為乙腈-水，梯度洗脫 (0～20 min，20%乙腈;20～30 min，20% ～25%乙腈;30～45 min，25% ～45%乙腈;45～48 min，45% ～90%乙腈);柱溫25℃;體積流量1 mL/min;使用蒸發(fā)光散射檢測器檢測。ELSD漂移管溫度110℃;載氣體積流量2.5 L/min。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對照品溶液的制備 分別取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、和Rd對照品適量，精密稱定，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別制成質(zhì)量濃度為0.4920、1.8811、0.1728、1.5652、0.4418 mg/mL貯備液。分別精密量取5個單標(biāo)溶液各5 mL，置于25 mL量瓶中，混合，搖勻，制成含三七皂苷 R1、人參皂苷 Rg1、Re、Rb1和 Rd分別為 0.0984、0.3762、0.0346、0.3130、0.0884 mg/mL的混合對照品貯備液。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取藍(lán)紅膠囊浸膏粉末0.75 g，精密稱定，置于50 mL圓底燒瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，80℃水浴回流4 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.3 陰性對照溶液的制備 按處方比例及制備工藝，制備不含三七的陰性樣品，同法制備陰性對照溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗 精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，按上述色譜條件，分別注入液相色譜儀，色譜圖見圖2。各待測組分峰的拖尾因子、分離度和塔板數(shù)見表1，說明系統(tǒng)適用性良好。

圖2 對照品 (A)、藍(lán)紅膠囊 (B)、陰性對照 (C)HPLC-ELSD色譜圖Fig.2 HPLC-ELSD chromatograms of reference substances(A)，Lanhong Capsules(B)and negative sample(C)

表1 系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果Tab.1 Results of applicability test for chromatographic systems

2.2.4 方法學(xué)驗證試驗

2.2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品貯備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于5 mL量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣10 μL，按上述色譜條件測定，分別以對照品的質(zhì)量對數(shù)值為橫坐標(biāo)，峰面積對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果三七皂苷 R1在0.1968～1.9680 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，y=1.74x+4.77，r=0.9996。人參皂苷 Rg1在0.1881～7.5243 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，y=1.76x+4.83，r=0.9994。人參皂苷 Re在0.1383～0.6914 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，y=1.39x+4.65，r=0.9993。人參皂苷 Rb1在0.0826～3.1304 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，y=1.80x+5.20，r=0.9994。人參皂苷 Rd在0.0884～1.7672 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，y=1.79x+5.24，r=0.9999。

2.2.4.2 精密度試驗 精密吸取對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，測得三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷 Re、人參皂苷 Rb1、人參皂苷Rd峰面積的 RSD分別為1.2%、0.7%、3.7%、0.7%、1.3%。表明儀器日內(nèi)精密度良好。連續(xù)5 d測試，測得三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷 Rb1、人參皂苷 Rd峰面積的RSD分別為 2.9%、1.7%、7.8%、1.6%和2.1%。表明儀器日間精密度良好。

2.2.4.3 重復(fù)性試驗 取同一批藍(lán)紅膠囊樣品(批號20121012)6份，精密稱定，按“2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定其三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷 Rb1、人參皂苷 Rd的量，其 RSD分別為0.8%、0.2%、2.7%、0.5%、1.7%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，室溫下放置，分別在0、3、6、12、24、48、72 h各進(jìn)樣10 μL，測定峰面積，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷 Rd的 RSD分別為 2.2%、0.4%、5.2%、1.4%、1.6%，表明供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4.5 回收率試驗 取已知含有量的供試品(批號20121012)0.37 g，精密稱定，共9份，分成3組，置50 mL圓底燒瓶中，分別精密加入三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷 Rd對照品溶液適量，按“2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，測定，計算回收率，結(jié)果見表2。

2.2.5 樣品測定 取7批藍(lán)紅膠囊樣品，按“2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，測定，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 關(guān)于中藥復(fù)方制劑中三七的質(zhì)量控制方法，文獻(xiàn)主要以薄層色譜法和高效液相色譜法為主［3-7］。藍(lán)紅膠囊成分較復(fù)雜，各成分之間存在相互干擾，試驗的關(guān)鍵是選擇適宜的展開系統(tǒng)。在藍(lán)紅膠囊中三七的薄層色譜鑒別，采用正丁醇-乙酸乙酯-水 (4∶1∶5)上層溶液為展開劑時，在不同類型硅膠薄層板上均可以達(dá)到理想的分離效果。薄層鑒別的耐用性試驗中比較了不同廠家、規(guī)格的薄層預(yù)制板、不同的濕度、溫度、顯色劑對試驗結(jié)果的影響，在不同條件下，均有較好的展開效果，表明該方法耐用性良好。

3.2 定量測定供試品溶液的制備方法考察中，對提取溶劑、提取方法、提取時間及提取次數(shù)進(jìn)行了考察，結(jié)果以80%甲醇為提取溶劑，回流4 h提取效果最佳。通過與《中國藥典》2010年版三七藥材供試品溶液的制備方法進(jìn)行比較，本法所測得5種指標(biāo)成分含有量均顯著高于藥典法，且本方法操作更加簡便。另外，通過對不同色譜柱、體積流量、柱溫等因素進(jìn)行考察，系統(tǒng)適用性較好，具有良好的耐用性。

表2 加樣回收試驗結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests

表3 藍(lán)紅膠囊測定結(jié)果 (n=3)Tab.3 Content determination of Lanhong Capsules(n=3)

3.3 通常，三七中皂苷類成分的分析常使用較低的紫外檢測波長 (203 nm)，但該波段為末端吸收，噪音信號很大。用于藍(lán)紅膠囊供試品溶液測定時，存在基線漂移不穩(wěn)，干擾多等缺點，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確。蒸發(fā)光散射檢測器 (ELSD)是一種新型的通用性質(zhì)量檢測器［8］。ELSD的響應(yīng)不依賴樣品的光學(xué)性質(zhì)［9］，任何揮發(fā)性第一流動相的樣品均能被檢測［10］，并且能與梯度洗脫方式相容，靈敏度高于紫外末端吸收檢測法［11-12］。通過調(diào)節(jié)ELSD檢測器的參數(shù)，可以使基線噪音最小，響應(yīng)值相對最高［13］。采用HPLC-ELSD法測定藍(lán)紅膠囊三七中皂苷類成分含有量，準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)，為藍(lán)紅膠囊的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

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