響應面分析法優化慢性濕疹搽劑提取工藝

易東陽，李勇華

(重慶三峽醫藥高等專科學校，重慶 404120)

慢性濕疹搽劑由苦參、紅活麻、蜂房、枯礬、生地、赤芍、牡丹皮、白鮮皮、蒺藜、蛇床子等10味中藥組成，具有養血涼血、滋陰潤燥、祛風止癢之效，主治血虛風燥型慢性濕疹。該制劑在重慶三峽醫藥高等專科學校附屬醫院臨床使用已有10余年，療效明顯，且無明顯不良反應。傳統一直依據經驗對處方中的苦參、紅活麻、生地、赤芍、牡丹皮、白鮮皮等藥材進行煎煮提取，為對提取工藝進行系統研究，本實驗采用響應面分析法［1-7］，對慢性濕疹搽劑提取工藝參數進行優化。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀，包括Alltech Model 428 HPLC Pump，Alltech UVIS 201型紫外檢測器，HT-230A型柱恒溫箱，Chromatography Data System色譜工作站 (美國奧泰公司)，色譜柱 Penomenex C18柱 (250 mm ×4.8 mm，5 μm)。AUW-120D型電子天平，(日本島津制作所株式會社)。

苦參 (Sophorae Flavescentis Radix)、蜂房 (Vespae Nidus)、枯礬 (Alumen)、生地 (Rehmanniae Radix)、赤芍(Paeoniae Radix Rubra)、牡丹皮 (Moutan Cortex)、白鮮皮(Dictamni Cortex)、蒺藜 (Fructus Tribuli)、蛇床子 (Cnidhi Fructus)等藥材均購自重慶市萬州區國藥集團，由重慶三峽醫藥高等專科學校胡玉彬副教授鑒定，藥材質量符合《中國藥典》2010年版規定;紅活麻購自重慶市儲奇門藥材市場，經重慶三峽醫藥高等專科學校胡玉彬副教授鑒定為蕁麻科艾麻屬植物珠芽艾麻Laportea bulbifera(Sieb.et Zucc.)Wedd.的干燥根;苦參堿對照品 (批號110805-200508，中國食品藥品檢定研究院);試劑均為分析純。

2 試驗方法與結果

測定不同提取方法所得樣品溶液的固體得率和苦參堿的量，分別乘以一定權重系數，采用綜合評分作為提取工藝的考察指標。

2.1 苦參堿的測定［8-12］

2.1.1 色譜條件 以氨基鍵合硅膠為填充劑;以0.0085 mol/L的醋酸銨甲醇溶液 (V甲醇∶V水=9∶1)為流動相;檢測波長為220 nm。理論板數按氧化苦參堿峰計算應不低于3500。

2.1.2 溶液的制備

2.1.2.1 樣品提取溶液的制備 按處方比例以一劑的處方量稱取各藥材，按一定的加水量、提取次數、每次提取時間進行提取、過濾，濾液濃縮至60 mL。

2.1.2.2 供試品溶液的制備 精密量取上述樣品溶液10 mL，加水10 mL，用濃氨試液調節至pH9～10，置分液漏斗中，用三氯甲烷萃取4次，每次20 mL，合并三氯甲烷萃取液，蒸干，殘渣加甲醇20 mL溶解，濾過，精密量取續濾液10 mL，加在中性氧化鋁柱 (100～200目，5 g，內徑1 cm)上，依次以三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇 (7∶3)混合溶液各20 mL洗脫，合并收集洗脫液，回收溶劑至干，殘渣加無水乙醇適量使溶解，轉移至10 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.1.2.3 對照品溶液的制備 取苦參堿對照品適量，精密稱定，加乙腈-無水乙醇 (80∶20)混合溶液分別制成每1 mL含苦參堿50 μg的溶液，即得。

2.1.3 標準曲線的繪制 精密稱取苦參堿對照品7.92 mg，置25 mL量瓶中，加乙腈-無水乙醇 (80∶20)混合溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液貯備液 (316.8 μg/mL);精密量取對照品溶液貯備液適量，分別加乙腈-無水乙醇 (80∶20)混合溶液稀釋制成每1 mL中含苦參堿為23.76、47.52、95.04、190.08、380.16 μg/mL 的標準溶液，在上述色譜條件下，分別測定不同質量濃度的苦參堿對照品溶液，以峰面積A為縱坐標，進樣質量濃度C為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程為A=20817C+27115(r=0.9999)，苦參堿溶液在23.76～380.16 μg/mL的質量濃度范圍內，其峰面積與測定質量濃度呈良好的線性關系。

2.1.4 精密度試驗 取苦參堿對照品溶液，重復進樣6次，測定并記錄其峰面積，計算RSD為0.33%，表明精密度良好。

2.1.5 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，分別于配制后0、2、4、6、8 h進樣，測定并記錄其峰面積，計算RSD為0.19%，說明供試品溶液在8 h內穩定性良好。

2.1.6 重復性試驗 取同一批號提取液，照“2.1.2”項供試品溶液的制備項下平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件進行測定，并記錄其峰面積，計算測定結果的RSD為0.46%，表明重復性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗 取已知苦參堿含有量的樣品6份，加入相應對照品溶液適量，制備供試品溶液，按上述色譜條件進行測定，并記錄其峰面積，結果苦參堿平均回收率102.2%，RSD為1.96%。說明該方法可行。

2.1.8 苦參堿的測定 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定，計算，即得。

2.2 提取液固體得率的測定 精密吸取“2.1.2”項下樣品提取溶液20 mL，置蒸發皿中，水浴蒸干，105℃干燥至恒定質量，計算，即得。

2.3 考察指標的確定［13-16］將苦參堿的質量濃度 (Y1:mg/mL)與固體得率 (Y2:g/mL)分別以不同權重進行處理，按公式Y=0.7 Y1+0.3Y2計算，得綜合評分作為考察指標。

2.4 單因素考察

2.4.1 提取時間對考察指標的影響 按處方比例稱取藥材，分別選定提取時間為30、60、90、120、180 min，設定加水量為藥材質量的8倍，提取次數為2次，提取樣品(每組3份)，按供試品溶液的制備方法，制備1～5組供試品溶液，計算固體得率，按苦參堿的測定方法進行測定，考察不同提取時間對固體得率和苦參堿量的影響，按“2.3”項下計算綜合評分，結果分別為0.112、0.165、0.173、0.181、0.180，提取時間為120 min時，固體得率與苦參堿的綜合得分最高，180 min之后隨著時間的加長反而有點下降，可能與煎煮時間過長有一定影響。

2.4.2 加水量對考察指標的影響 按處方比例稱取藥材，分別選定加水量為藥材量的5、8、10、15、20倍，設定提取時間為60 min，提取次數為2次，提取樣品 (每組3份)，按供試品溶液的制備方法，制備1～5組供試品溶液，計算固體得率，按“2.3”項下計算綜合評分，按苦參堿的測定方法進行測定，考察不同加水量對固體得率和苦參堿量的影響，按“2.3”項下計算綜合評分，結果分別為0.136、0.166、0.179、0.181、0.182。當加水量為藥材量的20倍，固體得率與苦參堿的綜合得分最高，但藥材加水量達到藥材量的10倍以后，繼續加大加水量對固體得率與苦參堿的綜合得分無顯著影響。

2.4.3 煎煮次數對考察指標的影響 按處方比例稱取藥材，分別選定煎煮次數為1、2、3、4、5次，設定加水量為藥材質量的8倍，提取時間60 min，提取樣品 (每組3份)，按供試品溶液的制備方法，制備1～5組供試品溶液，計算固體得率，按苦參堿的測定方法進行測定，考察不同煎煮次數對固體得率和苦參堿量的影響，按“2.3”項下計算綜合評分，結果分別為0.09、0.164、0.186、0.189、0.191。當煎煮次數為5次時，固體得率與苦參堿的綜合得分最高，但當煎煮次數達到3次以上后，繼續增加煎煮次數對固體得率與苦參堿的綜合得分無顯著影響。

2.5 慢性濕疹搽劑提取工藝條件的優化

2.5.1 響應面實驗設計及響應值結果 在單因素考察的基礎上，確定響應面的因素和水平，因素水平見表1。根據Box-Behnken的中心組合實驗設計原理確定的實驗設計方案及響應值結果，見表2。

2.5.2 模型擬合及預測 根據響應面實驗設計方案制備出15組供試品 (每組2份)，計算固體得率并按照苦參堿的測定方法進行測定，通過計算得出實驗數據如表2。通過design-expert 7.0軟件對響應值與各因素編碼值進行回歸擬合，得到回歸方程如下:Y=+21.48+1.01X1+1.10X2+2.04 X3+0.35X1X2+0.13 X1X3－0.15X2X3－1.40－3.13－2.20。方差分析結果見表3。

表1 慢性濕疹搽劑提取工藝響應面分析因素水平

表2 慢性濕疹搽劑提取工藝試驗設計及響應值

表3 慢性濕疹搽劑提取工藝回歸模型與方差分析

由表3可知，用上述回歸方程描述各因數與相應值之間的關系時，在置信區間95%時，因變量和全體自變量之間的線性關系顯著 (r=0.9671)，模型的顯著性水平遠低于0.05，表明模型項是顯著的。方程失擬項較小，表明該方程對實驗結果擬合良好，實驗誤差小。因此，可以用該方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析與預測。方程各自變量X方差分析表明，方程一次項對提取響應值具有顯著性影響，影響的大小順序依次為提取次數、提取時間、加水倍數，其中提取次數對提取響應值影響最為顯著。方程二次項對提取響應值具有顯著性影響，但交互項X1X2、X1X3、X2X3對提取響應值無顯著性影響，因此各因素與響應值之間不是簡單的線性關系。

2.5.3 等高線圖和響應面圖分析 根據回歸分析結果，用design-expert 7.0軟件作出響應曲面圖和等高線圖，見圖1～3。各圖表示X1、X2、X3中任意一個變量在取值范圍內，其余2個變量對提取響應值的影響。

圖1 加水量和提取時間對綜合評分的影響

圖2 加水量和提取次數對綜合評分的影響

圖3 提取時間和提取次數對綜合評分的影響

根據以上響應面圖，可以判斷該實驗范圍內只有一個穩定點，且為極大值，同時表明本實驗設計合理。因此，用design-expert 7.0軟件，由RSM預測得出慢性濕疹搽劑的最佳提取工藝條件為:加水倍數12.03，提取時間131.23 min，提取次數3.47，結合單因素優化實驗與生產實際的操作性，確定其最佳提取工藝為加水倍數12倍，提取時間130min，提取次數3次。理論上慢性濕疹搽劑提取響應值最高為0.2226。

2.5.4 驗證試驗 分別按優化的提取工藝提取3批樣品，測定固體得率和苦參堿量，計算綜合評分，慢性濕疹搽劑提取響應值為0.2212(RSD=0.42%)，與理論預測值相差不大，且高于表2實驗結果的最高值，說明所建模型正確，且建立的工藝穩定、提取率高、重現性好。

3 討論

本研究采用星點設計來進行試驗，從而避免了均勻設計和正交試驗不能預測出該因素在一個區間范圍內連續取值的最佳值的缺陷，且較好地保證了試驗精度 (可以分析各因素之間的相互作用)，預測性良好。根據方差分析結果可見，影響提取效果的大小順序依次為提取次數、提取時間、加水倍數，其中提取次數對提取響應值影響最為顯著。這可能與權重計算中苦參堿量所占比例較高有關，因濃度差對有效成分的溶出影響較大。

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