刺五加多糖對人宮頸癌HeLa細胞體外增殖和凋亡作用的實驗研究

靳 祎，劉 超，范林林，胡亞楠，盧雪崢，王恩軍

(1.河北大學基礎醫學院，河北保定 071000;2.保定市第一中心醫院，河北保定 071000;3.保定市兒童醫院，河北保定 071000)

中藥刺五加Acanthopanax senticosus為五加科植物，其根、莖、葉均可入藥，具有扶正固本、補腎安神的功效［1-2］。現代藥理學研究證實刺五加具有提高免疫、延緩衰老、抑制血栓形成和抗腫瘤等作用［3］。刺五加中含有的主要活性成分是刺五加苷和多糖［4］，近年來，隨著多糖分離技術的不斷成熟，其多糖活性也得到了進一步驗證。大量研究表明刺五加多糖具有很好的抗腫瘤作用［5］，具有巨大的開發潛能。本研究初步證實了刺五加多糖抗人宮頸癌Hela細胞增殖及促凋亡作用，并探討其機制，為其應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

腫瘤細胞株HeLa 由河北農業大學生命科學學院提供。刺五加多糖原生藥從河北安國縣藥材公司購買;采用熱水浸提法［6］提取，通過苯酚-硫酸法檢測含多糖量為75.12%，試驗前用生理鹽水配置成500 mg/mL的溶液。

1.2 試劑 胰蛋白酶和RPMI-1640培養液購自GIBCO公司，二甲基亞砜 (DMSO)、四甲基偶氮唑鹽 (MTT)購自Sigma公司，順鉑為齊魯制藥有限公司產品，瓊脂糖購自北京拜爾迪生物公司，溴化乙錠為研生生化試劑有限公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞抑制試驗 (MTT法) 將密度為2×104個/mL的細胞接種于96孔培養板中，貼壁生長24 h后用于試驗。分兩組，對照組加入生理鹽水，實驗組加入不同質量濃度的刺五加多糖 (分別為1、2、4、8、16 mg/mL)，48 h后加入MTT液，DMSO溶解，震蕩，酶標儀測定490 nm波長下各孔的吸光度值 (A490)，計算細胞增殖抑制率和半數抑制濃度 (IC50)。

1.3.2 細胞凋亡的檢測

1.3.2.1 DNA瓊脂糖凝膠電泳 取2瓶對數生長期的細胞，密度為5×108個/mL，分兩組，對照組加生理鹽水，實驗組加1.8 mg/mL的刺五加多糖，48 h后收集細胞，加細胞裂解液，蛋白酶K，然后經飽和酚、三氯甲烷/異戊醇多次抽提DNA，加醋酸鈉、無水乙醇沉淀DNA，75%乙醇漂洗。在2%瓊脂糖凝膠上點樣，1xTBE的電泳緩沖液電泳，紫外透射儀觀察梯形條帶并拍照。

1.3.2.2 促凋亡蛋白Bax的表達 采用免疫組化過氧化酶標記的鏈霉卵白素 (streptavidin peroxidase，SP)法，爬片經4%多聚賴氨酸預處理。細胞密度為2×105個/mL，培養24 h后，加入終質量濃度為1.8 mg/mL的刺五加多糖，培養48 h后，丙酮固定，血清封閉，滴加一抗、二抗工作液，辣根酶標記鏈霉卵白素，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察、攝片。

1.4 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，所有數據用表示，組間比較使用方差分析。

2 結果

2.1 細胞增殖的抑制作用 HeLa細胞在不同質量濃度的刺五加多糖作用下，增殖明顯受到抑制，A490值均下降，與對照組相比，差異有統計學意義 (P＜0.05，表1)，而且細胞抑制率隨藥物劑量增大而增強。通過MTT法作出的細胞生長曲線可以得出Hela細胞生長受抑制50%時的藥物濃度即半數抑制濃度IC50為1.8 mg/mL(48 h)。

表1 不同質量濃度的刺五加多糖對HeLa細胞增殖的抑制率(n=4，)

表1 不同質量濃度的刺五加多糖對HeLa細胞增殖的抑制率(n=4，)

注:與對照組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組 別 質量濃度/(mg·mL－1)A490 HeLa細胞抑制率/%－ 0.847±0.002 －刺五加多糖組 1 0.533±0.005＊＊ 37.04±0.17刺五加多糖組 2 0.378±0.009＊＊ 55.36±0.14刺五加多糖組 4 0.255±0.010＊＊ 69.85±0.15刺五加多糖組 8 0.097±0.003＊＊ 88.56±0.21刺五加多糖組 16 0.048 ±0.011＊＊對照組94.36±0.20

2.2 凋亡細胞的凝膠電泳 對照組細胞DNA呈現一個高分子量條帶，位于膠的頂部。刺五加多糖組細胞DNA呈現凋亡特異的降解片段，稱為“DNA Ladder”(見圖1)，表明刺五加多糖可誘導細胞凋亡。

圖1 細胞的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜

2.3 細胞中Bax蛋白的表達 Bax蛋白定位于胞漿，陽性產物染色呈棕黃色。在刺五加多糖的作用下，細胞中Bax表達明顯升高 (圖2)。由此說明，細胞的凋亡與Bax表達增強有關。

圖2 細胞中Bax蛋白的表達 (SP，400×)

3 討論

宮頸癌是女性第二大高發惡性腫瘤，臨床治療主要采用手術、放化療等方法［7］。目前，隨著研究的深入，抗宮頸癌的藥物也由傳統細胞毒性藥物轉向為多靶點、多機制的藥物。天然中草藥在宮頸癌的治療方面有著很好的應用前景。近些年，有關中藥及其有效成分的抗腫瘤作用研究也取得了重大成果，通過直接細胞毒作用、誘導細胞凋亡、抑制端粒酶活性、抗腫瘤血管生成、增強機體免疫力、調節細胞信號轉導、逆轉多藥耐藥等多種機制起作用。研究表明，很多中藥對宮頸癌有很好的抑制效果，而且一些單藥提取物已應用于臨床［8］。

刺五加屬五加科，是草藥刺五加的原植物。多年來，很多學者對刺五加的化學成分及藥理作用進行了大量的研究，證實了刺五加的活性成分及其良好的藥理作用。其中抗腫瘤作用作為刺五加研究中的一個熱點備受關注［9-10］。研究表明:刺五加對多種腫瘤，如藥物誘發性腫瘤、移植性腫瘤、腫瘤轉移及小白鼠自發性白血病均有一定的抑制作用。且刺五加多糖對小鼠肉瘤 S180細胞、人白血病K562細胞體外增殖有較強的抑制作用，能抑制腫瘤生長，適于用作抗癌輔助藥品［11］。本實驗結果發現刺五加多糖對體外培養的Hela細胞增殖有很強的抑制作用，抑制率隨其質量濃度增大而增強，顯示較好的劑量依賴關系。刺五加多糖對Hela細胞的IC50為1.8 mg/mL。

腫瘤的發生不但涉及細胞的異常增殖和分化，并且與細胞凋亡受阻有關［12］。很多藥物的抗癌機理都是誘導了腫瘤細胞的凋亡［13］。細胞凋亡是由基因控制的細胞自主的有序的死亡，它參與腫瘤發生的起始，并對腫瘤的發生起負相調控作用，涉及到一系列基因的調控。Bax是目前研究最廣泛且最深入的促凋亡基因之一［14］。很多報道顯示Bax蛋白在宮頸癌的發展中表達逐漸缺失，促進了細胞癌變［15］。本實驗中刺五加多糖作用 Hela細胞后，提取的DNA出現細胞凋亡的典型特征，有DNA Ladder凋亡條帶出現，說明刺五加多糖可以誘導Hela細胞凋亡，并且Bax蛋白在多糖作用細胞后表達水平明顯增加，證實Bax蛋白在Hela細胞凋亡過程中起到了促凋亡作用，增加了宮頸癌細胞凋亡的機會。以上結果表明，刺五加多糖是通過抑制細胞增殖和促進Bax蛋白表達增強、誘導細胞凋亡來發揮抗腫瘤作用的。

刺五加多糖的抗腫瘤作用機制復雜，是否還存在其他的作用機制有待于今后研究進一步闡明，相信隨著對刺五加多糖研究的深入及其作用機制的揭示，必將對刺五加多糖應用于宮頸癌的臨床治療提供科學依據。

［1］賈繼明，王宏濤，王宗權，等.刺五加的藥理活性研究進展［J］.中國現代中藥，2010，12(2):7-10.

［2］郭愛民.刺五加的現代研究進展［J］.中國現代藥物應用，2009，3(10):194.

［3］孫玉艷，崔玉海，李昭銘，等.刺五加多糖的研究進展探究［J］.中國新技術新產品，2012(7):2-3.

［4］王志睿，林敬明，張忠義.刺五加化學成分與藥理研究進展［J］.中藥材，2003，26(8):603-606.

［5］張敬一，許順江，楊慧敏，等.刺五加抗癌作用的實驗研究［J］.實用腫瘤學雜志，2004，18(6):422-427.

［6］孟凡欣，蔣朝軍，于笑坤，等.刺五加多糖的提取及含量測定［J］.工藝技術，2005，26(7):110-112.

［7］王小艷，稅 平，梁楠楠，等.宮頸癌治療方法的進展［J］.華北煤炭醫學院學報，2010，12(2):183-185.

［8］韓鳳娟，李小平，劉晨芳，等.中藥抗宮頸癌的現代機制研究進展及其優勢［J］.中醫藥信息，2012，29(5):101-104.

［9］杜佳新，顧玉紅，張 博，等.刺五加有效成分的抗腫瘤作用研究與評價［J］.中國醫院用藥評價與分析，2010，10(3):199-200.

［10］佟 麗，黃添友，梁 謀，等.刺五加多糖抗腫瘤作用與機理的實驗研究［J］.中國藥理學通報，1994，10(2):105-109.

［11］涂正偉，周渭渭，單 淇，等.刺五加的研究進展［J］.藥物評價研究，2011，34(3):213-216.

［12］Hengartner M O.The biochemistry of apoptosis［J］.Nature，2000，407(6805):770-776.

［13］羅 強，孫 黎，劉 芳，等.刺五加多糖對人白血病K562細胞作用的研究［J］.河北北方學院學報:醫學版，2008，25(5):17-19.

［14］遲萬好，曹明富，朱睦元.細胞凋亡的基因調控研究進展［J］.杭州師范學院學報，2001，18(5):45-49.

［15］王 妍，何慧儀.凋亡調控基因在宮頸癌的研究進展［J］.中國腫瘤，2011，20(9):675-679.