HPLC法同時測定婦炎凈片中4種成分

崔 玲，何云飛，徐燦輝

(1.益陽市中醫院，湖南益陽 413000;2.南華大學，湖南衡陽 421001)

婦炎凈片是由苦玄參、地膽草、當歸、兩面針、五指毛桃等九味中藥材組成的的復方制劑，具有清熱祛濕、行氣止痛的功效。其質量標準為“國家食品藥品管理局標準YBZ09362006-2009Z”，采用高效液相色譜法測定阿魏酸的量，未將君藥苦玄參的化學成分測定列入其中，為此，郭艷霞等［1］建立了高效液相色譜法測定苦玄參苷IA，婦炎凈其他劑型的苦玄參苷IA定量測定方法也有報道［2］。五指毛桃在處方中用量最大，具有健脾利濕、益肺止咳、舒筋通絡功效［3-4］，香豆素類成分補骨脂素和異補骨脂素是其主要功效性成分之一［5-6］，將其作為評價五指毛桃質量的依據已被廣泛采用［7-8］，但是在婦炎凈片中的定量測定研究目前未見報道。為了全面控制產品質量并簡化定量測定方法，本實驗以苦玄參苷IA、阿魏酸、補骨脂素和異補骨脂素作為指標性成分，采用高效液相色譜梯度洗脫法對4種成分同時定量測定，以控制方中苦玄參、當歸和五指毛桃的質量。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT高效液相色譜儀 (DAD檢測器)LC solution工作站，GB204電子分析天平 (梅特勒-托利多儀器有限公司)，CG-300超聲儀 (張家港市港威超聲電子有限公司)。苦玄參苷 IA對照品(111745-200501)，阿魏酸對照品 (110773-201313)，補骨脂素對照品 (110739-201115)，異補骨脂素對照品 (110738-201012)均購自中國食品藥品檢定研究院。婦炎凈片購自海南葫蘆娃制藥有限公司 (批號130407，0.5 g/片)、江西藥都仁和制藥有限公司(批號130115，0.4 g/片)、秦皇島皇威制藥股份有限公司 (批號130605，0.4 g/片)。乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱 (5 μm，4.6 mm×250 mm)(天津菲羅門科技有限公司生產);1%冰乙酸為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫 (0～15 min，85%A;15～20 min，85%A→63%A;20 ～35 min，63%A;35 ～40 min，63%A→85%A;40～45 min，85%A);體積流量1.0 mL/min;檢測波長245 nm;柱溫30℃;進樣量 10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別取苦玄參苷IA、阿魏酸、補骨脂素和異補骨脂素對照品，精密稱定，用甲醇溶解并定量稀釋制成質量濃度分別為750、125、50、60 μg/mL的溶液，作為對照品貯備溶液。各精密量取上述4種對照品的貯備溶液適量(0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL)，置同一25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成系列質量濃度的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品20片，除去包衣，精密稱定，研細，取約5片量，精密稱定，置50 mL量瓶中，加入甲醇適量，超聲處理30 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，過濾，精密量取續濾液25 mL，置蒸發皿中，蒸干，用甲醇溶解轉移至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照樣品溶液 按處方量和制備工藝分別制備缺苦參的樣品、缺當歸的樣品、缺五指毛桃的樣品和同時缺苦玄參、當歸和五指毛桃的樣品，同供試品溶液制備方法制備陰性對照樣品溶液。

2.3 專屬性 取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液分別注入色譜儀，記錄色譜圖。由圖1可見，陰性樣品溶液不干擾測定。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.4 線性 取“2.2.1”項配制的系列質量濃度混合對照品溶液，照上述色譜條件試驗，記錄色譜圖，以峰面積 (Y)對質量濃度 (X)進行線性回歸，得到4種分析物的回歸方程、相關系數，結果見表1。

表1 4種成分的線性范圍及回歸方程Tab.1 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients of four constituents

2.5 精密度試驗 取混合對照品溶液連續進樣6次，記錄色譜圖，苦玄參苷IA、阿魏酸、補骨脂素和異補骨脂素峰面積平均值的相對標準偏差(RSD)分 別 為 0.41%、0.63%、0.59%、0.44%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 取樣品 (批號130115)按“2.2.2”項制成供試品溶液，共6份，記錄色譜圖，將峰面積代入“2.4”項線性回歸方程計算各成分量。每片含苦玄參苷IA、阿魏酸、補骨脂素和異補骨脂素的平均值分別為233、41、15、18 μg，相對標準偏差 (RSD)分別為 0.58%、0.68%、0.77%、0.85%，表明本法有較好的重復性。

2.7 穩定性試驗 取樣品 (批號130115)按“2.2.2”項制成的供試品溶液，每隔2 h進樣1次，共6次，記錄色譜圖，苦玄參苷IA、阿魏酸、補骨脂素和異補骨脂素峰面積平均值的相對標準偏差 (RSD)分別為 1.38%、1.05%、1.26%、0.88%，表明樣品溶液在12 h內穩定。

2.8 加樣回收率試驗 取已測定樣品 (批號130115)約2.5片，精密稱定，共9份，分別按樣品中所含各成分的80%、100%和120%計算，加入4種對照品的貯備溶液，按供試品溶液制備方法處理，按上述色譜條件測定，將峰面積代入“2.4”項線性回歸方程計算各成分量，計算回收率。結果見表2。

表2 回收率試驗結果 (n=9)Tab.2 Results of recovery tests(n=9)

2.9 樣品測定 取3個不同生產廠家不同批號的樣品，按照“2.2.2”項進行處理，每批平行處理5份，按上述色譜條件測定，將峰面積代入“2.4”項下線性回歸方程計算，結果見表3。

表3 婦炎凈片中4種成分的測定結果 (n=5)Tab.3 Determination of four constituents in Fuyanjing Tablets(n=5)

3 討論

由于4種成分的極性差別較大，同時測定時采用梯度洗脫才能有效分離。根據各成分的理化性質和色譜行為，分別采用了以甲醇與水、乙腈與純水、1%冰乙酸溶液與乙腈構成的洗脫系統。結果表明，以甲醇與水為系統基線的波動較大，各成分的分離效果不理想，乙腈-純水系統色譜峰拖尾明顯，1%冰乙酸溶液與乙腈系統各成分的色譜峰峰型對稱，理論塔板數高，分離度好。

通過調取DAD檢測的紫外光譜可知苦玄參苷IA、阿魏酸、補骨脂素和異補骨脂素的最大吸收波長分別為264、316、245、246 nm，與相關文獻一致［9-12］，由于苦玄參苷IA、阿魏酸在245 nm附近均有較強吸收，補骨脂素和異補骨脂素的最大吸收波長相近，補骨脂素在4種成分中含有量最低，因此，選擇補骨脂素的最大吸收波長作為檢測波長，均能滿足定量測定的要求。

實驗分別用乙醇、70%甲醇和甲醇作為溶劑對樣品分別進行冷浸，回流和超聲提取，結果表明甲醇超聲提取完全且雜質干擾峰較少。對超聲處理15、20、25、30、35 min進行考察，結果表明超聲處理25 min后各成分量不再增加，考慮到樣品的差異性，選擇超聲處理30 min。

本實驗采用高效液相色譜法梯度洗脫，能快速、準確地同時測定婦炎凈片中苦玄參苷IA、阿魏酸、補骨脂素和異補骨脂素的量，可作為婦炎凈片質量標準改進的參考。

［1］郭艷霞，劉 敬，陳道蓉，等.HPLC法測定婦炎凈片中苦玄參苷IA的含量［J］.成都中醫藥大學學報，2008，31(3):54-56.

［2］唐秀玲，呂軼峰.HPLC法測定婦炎凈膠囊中苦玄參苷IA的含量［J］.中國藥師，2011，14(3):429-430.

［3］現代中藥學大詞典編委會.現代中藥學大詞典［M］.北京:人民衛生出版社，2001:371.

［4］王偉偉，陳 瑤.五指毛桃的化學成分和藥理作用研究進展［J］.中國民族民間醫藥，2013，41(2):41-42.

［5］林 慧，梅全喜，曾聰彥.五指毛桃化學成分及其藥理活性研究概況［J］.今日藥學，2012，22(8):484-486.

［6］林 勵，鐘小清，魏 剛.五指毛桃揮發性成分的GC-MS分析［J］.中藥材，2000，23(4):206-207.

［7］王曉平，黃 翔，陸奇豐，等.HPLC測定不同葉型五指毛桃中補骨脂素的含量［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19(5):93-95.

［8］黃文華，宋艷剛，李占永，等.廣東不同產地五指毛桃藥材中補骨脂素及微量元素的含量測定及質量評價［J］.西部中醫藥，2013，26(4):14-16.

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［10］黃筑艷，張吉明.HPLC測定婦炎凈軟膠囊中阿魏酸的含量［J］.長春師范學院學報，2010，29(1):75-76.

［11］李 明，陳志維，黎玉翠，等.HPLC法測定五指毛桃中補骨脂素和芹菜素的含量［J］.中藥新藥與臨床藥理，2009，20(1):53-54.

［12］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:174.