小葉榕葉抗炎成分分析及活性評價

黃 洋，邵慧凱，李 康，劉盛權，謝淑桐

(廣東藥學院藥科學院，廣東廣州 510006)

小葉榕葉是桑科植物榕屬小葉榕Ficus microcarpa的干燥葉子，全年可采，陰干入藥，其作為嶺南民間用藥，在我國南方分布廣泛，其水提物干浸膏作為咳特靈膠囊的主要成分被收載在《中華人民共和國衛生部藥品標準》中藥成方制劑第十四分冊中。小葉榕葉具有抗炎、殺菌、鎮痛和止咳平喘等作用［1］，臨床上常將其干浸膏用于咳嗽、哮喘等多種疾病的治療［2］。它抗炎的藥效已有大量相關文獻報道［3］，但從有效部位的角度去研究其抗炎藥效物質罕見相關文獻報道，此外，采用脂多糖 (Lipopolysaccharide，LPS)建立體外炎癥模型去探討其作用機理也未見學者涉足。深入了解炎癥的作用機理，可對中藥小葉榕葉的抗炎藥效物質基礎提供可靠的理論指導。前期研究結果發現其有效部位在小葉榕葉水提物的乙酸乙酯層萃取部位［4］;本研究主要對該部位進行化學成分分析以及活性評價，為尋找其發揮抗炎藥效的物質基礎以期為小葉榕葉浸膏的質量控制提供可靠的數據參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 AUW220D型十萬分之一電子天平(日本島津公司);Kafler顯微熔點測定儀 (北京泰克儀器有限公司);旋轉蒸發器 (鞏義市英峪高科儀器廠);渦旋混合器 (天津藥典標準儀器廠);HH-S型恒溫水浴鍋 (鞏義市予華儀器有限公司);電熱套 (海寧市新華醫療器械廠);AVANCEIII500MHz型核磁共振波譜儀 (瑞士布魯克拜厄斯賓有限公司);Bruker AVANCEIII 500MHz全數字超導核磁共振譜儀 (瑞士 Bruker公司);GZX-9240MBE型數顯鼓風干燥箱 (上海博迅實業有限公司醫療設備廠);WFH-203型三用紫外分析儀(上海精科實業有限公司)。PerkinElmer Spectrum-100型傅立葉變換紅外光譜儀 (KBr壓片);Bruker AV-400超導核磁共振儀 (瑞士Bruker公司);四級桿串聯飛行時間質譜 (美國Waters公司)。CO2培養箱 (美國Thermo electron公司);倒置顯微鏡(廣州湘儀機電設備有限公司);超凈工作臺 (蘇州凈化設備廠);全波長多功能酶標儀 (美國Biorad公司)，HH-S型恒溫水浴鍋 (鞏義市予華儀器有限公司);離心機 (美國Thermo electron公司)。

1.2 試劑和藥材 小葉榕新鮮葉子采自廣州大學城穗石村，經廣東藥學院中藥學院生藥學教研室劉基柱教授鑒定為桑科榕屬的植物榕樹的葉，采摘葉子于室內陰干。

RAW264.7細胞株 (中山大學實驗動物中心細胞庫);地塞米松 (Dexamethasone，DEX，上海源葉生物科技有限公司);LPS(美國Sigma公司，L2880);DMEM培養基 (美國 Hyclone公司);胎牛血清 (Gibco公司);胰酶 (Gibco公司);雙抗(Hyclone公司);噻唑藍 (美國 Axygen公司);NO檢測試劑盒 (碧云天生物技術研究所);TNF-α試劑盒 (武漢華美生物工程有限公司);血球計數板 (上海求精生化試劑儀器有限公司);DMSO(天津市大茂化學試劑廠)，PBS(北京鼎國昌盛生物科技技術有限責任公司);柱層析硅膠 (200～300目，分析純)、薄層層析硅膠G(青島海洋化工集團);化學試劑均為分析純。顯色劑為10%硫酸乙醇溶液，乙醇為食用級，實驗中所用其他試劑均為分析純。

2 提取與分離

2.1 提取 取新鮮陰干后小葉榕葉約20 kg，剪碎后水提取，液料比20∶1，回流提取3次，每次2 h，濃縮至適當的相對密度后，靜置冷卻。按部頒標準用95%乙醇醇沉至含醇體積分數為80%～85%，慢加快攪，靜置24 h，抽濾，回收乙醇。在旋轉蒸發儀上減壓濃縮，加水形成懸浮液，加石油醚脫酯，水相加乙酸乙酯萃取，取有機相，減壓濃縮，得到乙酸乙酯浸膏，真空干燥。

2.2 分離 取乙酸乙酯層干浸膏約200 g，與適量硅膠 (200～300目)研磨均勻，在干燥器中揮干，上硅膠柱 (200～300目)，其洗脫溶劑和比例見圖1和圖2所示，減壓旋干，根據TLC檢識結果合并相近的流份，各部分經反復硅膠柱層析和重結晶得到化合物1～10。

3 細胞培養

取對數生長期的細胞，經0.25%胰酶消化，用含 10%胎牛血清、100 μL/mL青霉素、0.1 mg/mL硫酸鏈霉素的 DMEM培養基，于37℃、5%CO2培養箱中培養。根據代謝情況1～2 d換一次液，至對數期備用。

圖1 化合物結構圖Fig.1 Structure of ten compounds

圖2 小葉榕葉乙酸乙酯層分離流程圖Fig.2 Flow chart of the ethyl acetate layer from Ficus microcarpa L.f.

3.1 各單體成分對RAW264.7細胞活性的影響取對數生長期的RAW264.7細胞，用0.25%的胰酶消化，吹打，使其成為均勻的單細胞懸液，計數細胞，用培養基稀釋成約1.2×105個/mL并接種于96孔板中，每孔100 μL，置37℃、5%CO2培養箱培養4 h。細胞貼壁后，試驗組加入試驗藥物(50.0、10.0、5.0、1.0、0.1 μg/mL)和陽性藥物地塞米松 (10.0 μg/mL)，正常組 (不加藥物的細胞空白孔)，LPS組 (1.0 μg/mL)、調零孔 (不接種細胞的空白孔)，溶劑組 (含0.1%DMSO)，每個質量濃度設置5個復孔。連續孵育20 h，在實驗結束前4 h，每孔加入 MTT(5.0 mg/mL)20 μL，繼續孵育至實驗結束，吸棄上清，每孔加入150 μLDMSO充分溶解細胞沉淀，振蕩15 min，在l h內用酶標儀在波長490 nm測量，參比波長為630 nm處測定OD值，實驗重復3次。藥物對細胞生長的抑制作用以存活率表示，存活率越高，表明藥物毒性越低。存活率計算公式如下:

存活率 (%)=(藥物干預孔A －空白對照孔A)/(正常細胞孔A－空白對照孔A)×100%。

3.2 細胞培養液中NO測定 取對數生長期的RAW264.7細胞，用0.25%的胰酶消化，吹打，使其成為均勻的單細胞懸液，計數細胞，用培養基稀釋成約1.0×105個/mL并接種于96孔板中，每孔100 μL，于37℃、5%CO2培養箱培養4 h。細胞貼壁后，設置正常組、LPS組、給藥組 (各單體成分50.0 μg/mL，20 μg/mL，10.0 μg/mL)和陽性藥物DEX(10.0 μg/mL);再往培養體系中加入終質量濃度為1.0 μg/mL LPS作為刺激劑，置37℃，5%CO2培養24 h，輕輕吸取上清。按照NO試劑盒操作進行檢測;抑制率 (%)=(模型組細胞因子濃度－給藥組細胞因子濃度)/(模型組細胞因子濃度－正常組細胞因子濃度)×100%。

3.3 ELISA法檢測各單體成分對TNF-α的抑制作用 取對數生長期的RAW264.7細胞，用0.25%的胰酶消化，吹打，使其成為均勻的單細胞懸液，計數細胞，用培養基稀釋成約2.5×105個/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，于37℃、5%CO2培養箱培養4 h。細胞貼壁后，設置正常組、LPS組、給藥組 (各單體成分 50.0μg/mL，20 μg/mL，10.0 μg/mL)和陽性藥物 DEX(10.0 μg/mL);再往培養體系中加入終質量濃度為1.0 μg/mL LPS作為刺激劑，置37℃，5%CO2培養24 h，收集上清液并以酶標儀讀取450 nm波長處的吸光度值，根據相應的ELISA試劑盒說明書操作并根據標準曲線計算TNF-α的量，并進行組間比較;抑制率 (%)=(模型組細胞因子濃度－給藥組細胞因子濃度)/(模型組細胞因子濃度－正常組細胞因子濃度)×100%。

4 統計學分析

各項實驗重復3次，使用 SPSS 17.0中的one-way ANOVA進行多個樣本間的兩兩比較，結果以來表示，P＜0.05為結果具有顯著性差異。

5 結果

5.1 化合物結構鑒定

化合物1:無色針晶，mp 122～124℃。IR(KBr)νmax:3071，3012，2952，2834，2672，2 558， 1 688， 1 583， 1454 cm－1。1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ:8.16(2H，d，J=7.7 Hz，2，6-H)，7.65(1H，t，J=7.4 Hz，4-H)，7.52(2H，t，J=7.7 Hz，3，5-H)。13C-NMR(126 MHz，CDCl3)δ:172.55(C-7)，134.04(C-4)，130.44(C-6)，129.54(C-2)，128.72(C-3，5)，130.1(C-1)。以上數據與文獻 ［5］報道一致，可以確定化合物1為苯甲酸。

化合物2:白色結晶，mp 130～131℃。IR(KBr)νmax:3400，2956，1705，1610，1452，1410 cm－1。1H-NMR(500 MHz，MeOD)δ:7.02(2H，dt，J=8.6，2.8，2.1 Hz，2，6-H)，6.69(2H，dt，J=8.6，2.8，2.1 Hz，3，5-H)，2.79(2H， t， J=7.7Hz)，2.52(2H， t， J=7.7 Hz)。13C-NMR(126 MHz，MeOD)δ:176.96(C-3')，156.78(C-4)，132.96(C-1)，130.26(C-2，6)，116.32(C-3，5)，37.21(C-1')，31.27(C-2')。其中7.02(2H，dt，J=8.6，2.8，2.1 Hz，2，6-H)，6.69(2H，dt，J=8.6，2.8，2.1 Hz，3，5-H)，這兩組氫信號表明苯環存在1，4取代模式。碳譜中出現δ 176.96(s)為羧酸中羰基碳信號。以上數據與文獻 ［6］報道一致，可以確定化合物2為對羥基苯丙酸。

化合物3:白色針晶，mp 212～213℃。IR(KBr)νmax:3372，1700，1620，1523，1463 cm－1。1H-NMR(500 MHz，MeOD)δ:7.35(s，1H)，δ 3.91(d，J=4.2 Hz，3H)。13C-NMR(126 MHz，MeOD)δ:168.6(s)，147.66(s)，107.18(s)，55.60(s)。但從1H-NMR和13C-NMR可以看出，出現了4個碳信號和兩個氫信號，所以推測其可能含有一對稱結構，而其中δ 3.91(d，J=4.2 Hz，3H)為甲氧基信號，據此可以推測在苯環上有一對稱取代的甲氧基。δ 7.35(s，1H)為苯環對稱1，3，4，5取代的信號。以上數據與文獻 ［7］報道一致，可以確定化合物3為3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲酸。

化合物4:白色針晶，mp 150～153℃。IR(KBr)νmax:3366，2975，2898，1711，1616，1517 cm－1。1H-NMR(500 MHz，MeOD)δ:7.12(2H，d，J=9.0 Hz)，6.78(2H，d，J=9.0 Hz)，3.49(s，2H)。13C-NMR(126 MHz，MeOD)δ:175.11(s)，156.23(s)，130.14(s)，125.63(s)，115.10(d，J=24.8 Hz)，47.81(dp，J=42.9，21.4 Hz)，39.94(s)。在芳香區給出了兩組芳香質子信號δ 7.12(2H，d，J=9.0 Hz)，δ 6.78(2H，d，J=9.0 Hz)提示對位取代苯的存在。以上數據與文獻［8］報道一致，可以確定化合物4為對羥基苯乙酸。

化合物5:白色針晶，mp 160～161℃，IR(KBr)νmax:3239，2864，1668，1525，1405 cm－1。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ:10.42(2H，2-OH，7-OH)，7.97(dd，J=8.0，1.7 Hz，1H，H-6)，7.53(1H，dt，J=1.5，8.0 Hz，H-4)，7.05(d，J=8.4 Hz，1H，H-3)，6.96(1H，J=8.0 Hz，H-5)。13C-NMR(126 MHz，CDCl3)δ:176.25(C-7)，163.64(C-2)，138.44(C-4)，132.40(C-6)，121.06(C-5)，119.29(C-3)，112.75(C-1)。以上數據與文獻 ［9-10］基本一致，可以確定化合物5為水楊酸。

化合物6:白色針晶，mp 123～125℃，IR(KBr)νmax:3369，2984，2945，1665，1604，1517，1463 cm－1。1H-NMR(500 MHz，MeOD)δ:8.04(1H，4-OH)，7.32(2H，s，H-2，6)，3.92(6H，s，3，5-OMe)，2.57(3H，s，8-Me)。13CNMR(126 MHz，MeOD)δ:197.4(C-7)，147.78(C-3，5)，140.13(C-4)，127.98(C-1)，106.25(C-2，6)，55.65(3，5-OMe)，25.10(C-8)。以上數據與文獻［11］基本一致，可以確定化合物6為3，5-二甲氧基-4 羥基-苯乙酮。

化合物7:白色針狀結晶，IR(KBr)νmax:3385，2976，1690，1594，1448 cm－1。1H-NMR(500 MHz，MeOD)δ:7.89(m，1H)，7.03(2H，m，H-4，6)，6.83(1H，d，J=7.9 Hz，H-5)，6.70(1H，d，J=7.9 Hz，H-5)，2.82(2H，t，J=6.1 Hz，H-7)，2.55(2H，t，J=6.1 Hz，H-8)。13C-NMR(126 MHz，MeOD)δ:175.82(C=O)，155.51(C-2)，131.80(C-1)，129.04(C-6)，121.51(C-5)，114.93(C-3)，36.00(C-8)，30.04(C-7)。以上數據與文獻 ［12］基本一致，可以確定化合物7為鄰羥基苯丙酸。

化合物 8:白色粉末，mp 61～63℃，IR(KBr)νmax:3367，2925，2854，1712 cm－1。1HNMR(500 MHz，CDCl3)δ:2.34(2H，t，J=7.5Hz)，1.62(2H，m)，1.30(11H，m)，0.92(3H，t)。13C-NMR(126 MHz，CDCl3)δ:180.29(C=O)，34.28(C-2)，32.1(C-13)，30.35 ～28.39(C-4～C-12)，24.89(C-3)，22.91(C-14)，14.33(C-1)。以上數據與文獻 ［13］基本一致，可以確定化合物8為十五烷酸。

化合物 9:無色針晶，mp 86～88℃，IR(KBr)νmax:3444，2965，2941，2858，1708，1470，1059 cm－1。1H-NMR(500 MHz，MeOD)δ 3.53(tt，J=10.7，3.9 Hz，1H)，2.33 ～ 2.15(m，1H)，2.01(dd，J=8.5，4.8 Hz，4H)，1.56～1.40(m，2H)，1.39～1.17(m，2H)。13CNMR(126 MHz，MeOD)，179.52(C-1)，70.57(C-2)，43.53(C-3)，35.34(C-4)，28.53(C-5)。以上數據與數據庫 ［14］中2-羥基-3-甲基丁酸報道一致［14］。

化合物10:白色針晶，mp 122～124℃，IR(KBr)νmax:3297，3025，2956，2934，1743，1593，1518，1445 cm－1。13C-NMR(126 MHz，MeOD)δ:179.06(s)，156.19(s)，130.43(s)，127.21(s)，115.16(d，J=12.3 Hz)，82.08(s)，40.05(s)，28.30(s)，26.66(s)。1H-NMR(500 MHz，MeOD)δ:7.12(2H，d，J=9.0 Hz)，6.78(2H，d，J=9.0 Hz)提示對位取代苯的存在。以上數據與數據庫中對羥基苯甲酸仲丁酯報道一致［15］。

5.2 單體化學成分MTT細胞活性試驗 將不同質量濃度各單體化學成分 (0.1、1.0、5、10、50 μg/mL)以及陽性藥物 DEX(10.0 μg/mL)、LPS組 (1.0 μg/mL)、溶劑組 (加入0.1%DMSO培養基)和各質量濃度水提物 (0.3、0.6、1.0、2.3、4.5 μg/mL)刺激24 h后，巨噬細胞活性通過MTT法檢測，相比正常組結果如圖3所示:各單體成分在0.1～50 μg/mL范圍內以及DEX、LPS組、溶劑組 (0.1%DMSO培養基)對RAW264.7細胞的活力均無影響，結果見圖3。

圖3 不同質量濃度各單體化學成分及水提物和相關試劑對RAW264.7細胞的存活率影響Fig.3 Effects of the isolated chemical compositions and the water extract，adding up to related reagents combining with solvent on RAW264.7 viability

5.3 單體化學成分對RAW264.7細胞上清液中NO因子釋放的抑制情況 用LPS刺激RAW264.7細胞可產生大量的NO，模型組細胞上清液中NO產物亞硝酸鹽量顯著提高，與空白對照組相比有顯著性差異 (P＜0.01);各單體化學成分的不同劑量在24 h內對細胞上清液中亞硝酸鹽量的抑制情況，結果見表1、圖4。

表1 各單體化學成分對RAW264.7細胞分泌NO的影響Tab.1 Effect of the chemical compositions on NO secretion in RAW264.7

5.4 各單體化學成分對RAW264.7細胞上清液中TNF-α因子釋放的抑制情況 結果顯示 LPS 1.0 μg/mL誘導大鼠腹腔巨噬細胞分泌TNF-α，且與空白對照組相比有顯著性差異 (P＜0.01);不同質量濃度各單體化學成分對LPS誘導的巨噬細胞中TNF-α的分泌的抑制情況見下表2。

圖4 NO抑制率柱狀圖Fig.4 Histogram of NO inhibition

表2 各單體化學成分對RAW264.7細胞分泌TNF-α的影響Tab.2 Effect of the chemical compositions on TNF-α secretion in RAW264.7

6 討論

小葉榕葉是嶺南常用中草藥，始載于《南方草木狀》，有著廣泛民間用藥基礎［16］。其乙酸乙酯層具有抗炎藥效早有文獻報道［2］，且經本課題組前期試驗研究也證實無誤，但深究其抗炎藥效的物質基礎研究頗少，前期藥效研究已篩選出有效部位為乙酸乙酯萃取部位，故本研究采用硅膠柱層析、重結晶等手段從有效部位化學成分群中分離純化并得到了10個單體成分，并測試了10個單體化合物對巨噬細胞RAW264.7的生長抑制作用以及對RAW264.7細胞中NO和TNF-α代謝的抑制情況。結果顯示，各單體成分在0.1～50 μg/mL范圍內對細胞的增殖抑制作用情況并無影響，將各單體成分 (高、中、低3個濃度水平)分別刺激LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7炎癥模型，通過檢測細胞上清液中釋放NO和TNF-α因子的表達發現，與模型組相比較，炎癥因子NO的測試結果發現有6個藥效顯著的單體化合物，分別是苯甲酸、對羥基苯丙酸、3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲酸、對羥基苯乙酸、水楊酸、對羥基苯甲酸仲丁酯。其抑制率大小見表1，其中苯甲酸、水楊酸、對羥基苯丙酸存在一定劑量依賴性。此外，采用ELISA試劑盒對該細胞上清液中TNF-α表達情況進行測試發現，利用SPSS統計學軟件處理數據，相比較模型組，藥效顯著的單體成分為苯甲酸、3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲酸、對羥基苯乙酸、水楊酸、3，5二甲氧基-4-羥基-苯乙酮、鄰羥基苯丙酸。其抑制率大小情況見表2，其中3，5二甲氧基-4-羥基-苯乙酮呈現出較好的劑量依賴性。

中藥藥效物質基礎是指中藥進入人體內作用于多個靶點并產生整體功效的化學成分組［17］，本研究采用生物活性追蹤中藥活性成分的分離純化，最終闡明中藥活性成分與藥效之間的關聯性。實驗結果也顯示出小葉榕葉發揮藥效也具有整體性和多靶標性的特點。該藥效物質的發現可為下一步控制小葉榕浸膏的質量標準提供可靠參考，同時也為小葉榕葉發揮抗炎藥效的物質基礎和作用本質進行揭示。

［1］劉力恒，王立升，王天文，等.小葉榕化學成分及藥理活性的研究進展［J］.時珍國醫國藥，2008，19(2):390-392.

［2］戴 臻，李書淵，房志堅，等.HPLC法測定不同采收期小葉榕葉中異牡荊苷的含量［J］.廣東藥學院學報，2008，24(3):231-235.

［3］陳 露，藍鳴生，王 碩.小葉榕不同提取物的主要藥效學研究［J］.廣西植物，2009，29(6):871-874.

［4］陳艷芬，江 濤，唐春萍，等.小葉榕不同提取物鎮咳祛痰作用的比較研究［J］.中醫藥導報，2010，16(7):98-99.

［5］黃肖霄，牛 超，高品一，等.山楂葉的化學成分［J］.沈陽藥科大學學報，2007，27(8):615-616.

［6］劉岱琳，龐發根，張家欣，等.密花石豆蘭的化學成分研究［J］.中國藥物化學雜志，2005，15(2):104-107.

［7］張衛東，陳萬生，孔德云，等.燈盞細辛化學成分的研究［J］.中國藥學雜志，2000，35(8):514-516.

［8］廖志新，王明奎，彭樹林，等.菱葉紫菊的化學成分［J］.藥學學報，2002，37(1):37-40.

［9］吳 斌，吳立軍，張 磊，等.麻葉千里光抗菌化學成分的研究［J］.沈陽藥科大學學報，2004，21(5):341-345.

［10］王 勇，王 英，王國才，等.舞草的化學成分［J］.中國天然藥物，2007，5(5):357-359.

［11］王曉良，陳明華，王 芳，等.板藍根水提取物的化學成分研究［J］.中國中藥雜志，2013，38(8):1173-1182.

［12］陳 輝，楊立功，鄭曉珂，等.蔓生卷柏的化學成分研究［J］.天然產物研究與開發，2012，24(7):903-904.

［13］李彥文.小葉榕化學成分和質量標準研究 ［D］.北京:北京中醫藥大學，2008:5.

［14］Yamaji T，Saito T，Hayamizu K，et al.National institute of advanced industrial science and technology(AIST)［DB］.SpectralDatabase for Organic Compounds， Japan， 2007，SDBS:13307.

［15］Yamaji T，Saito.T，Hayamizu K，et al.National institute of advanced industrial science and technology(AIST) ［DB］.Spectral Database for Organic Compounds，Japan，2007，SDBS:6930.

［16］李彥文，孫志蓉，李志勇，等.小葉榕鎮咳祛痰及抗炎藥理作用研究［J］.時珍國醫國藥，2010，21(11):3-4.

［17］陳 梅，趙 鑫，沈 舒，等.中藥藥效物質基礎研究思路與方法概述［J］.海峽藥學，2010，22(3):11-13.