補(bǔ)骨脂有效成分在大鼠血清、肝、腎中的測(cè)定

張 昀，張 瑜

(河南大學(xué)藥學(xué)院，河南開封 475001)

補(bǔ)骨脂是常用中藥之一，具有溫補(bǔ)脾腎、壯陽止瀉之功效，目前已從中分離鑒定出三十余種化合物。現(xiàn)代藥理研究表明，補(bǔ)骨脂具有抑制分離破骨細(xì)胞、抑制人胃癌細(xì)胞的生長、抗氧化、抗菌抗病毒、增強(qiáng)免疫力等作用［1-12］。補(bǔ)骨脂藥材中主要活性成分為補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素［13-15］，其定量測(cè)定已收載于《中國藥典》2010年版［16］。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在建立一種同時(shí)測(cè)定大鼠血清、肝臟、腎臟中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的量的方法，為兩者在體內(nèi)的分布規(guī)律及藥代動(dòng)力學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器及試劑

AE200S電子分析天平 (上海梅特勒-托利多儀器有限公司);Agilent 1260型高效液相色譜儀;氯霉素 (中國藥品生物制品檢定所，產(chǎn)品批號(hào)130303-200614);補(bǔ)骨脂素對(duì)照品 (批號(hào)110739-201115，供含量測(cè)定用，中國食品藥品檢定院);異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品 (批號(hào)110738-201012，供含量測(cè)定用，中國食品藥品檢定研究院);甲醇、乙腈為色譜純 (均為天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司);水為超純水;其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent TC-C18(2)高效液相色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為水(A)-乙腈 (B)(65∶35)，梯度洗脫 (0～10 min，35%B→45%B;10～25 min，45%B→50%B)，體積流量1 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長295 nm(0～10 min，氯霉素)，246 nm(10～25 min，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素)，進(jìn)樣量20 μL。圖譜見圖1。

圖1 對(duì)照品溶液和樣品溶液的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and samples

2.2 對(duì)照品貯備液的配制 精密稱取補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品分別至10 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，搖勻，儲(chǔ)存于4℃冰箱待用。

2.3 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取氯霉素對(duì)照品至25 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，搖勻，儲(chǔ)存于4℃冰箱待用。

2.4 供試品溶液的制備

2.4.1 血清供試品溶液 精密吸取內(nèi)標(biāo)溶液20 μL置具塞離心管中，于緩和氮?dú)饬飨麓蹈扇軇尤胙鍢悠?200 μL，乙酸乙酯-正己烷 (8 ∶1)800 μL，渦旋 2 min，低溫離心 10 min(12000 r/min)，分取上層有機(jī)相置另一試管中，于緩和氮?dú)饬飨麓蹈扇軇瑲堅(jiān)?00 μL甲醇溶解，即得。

2.4.2 肝臟供試品溶液 稱取肝臟相同部位0.3 g，加生理鹽水0.5 mL，10000 r/min勻漿，離心10 min(5000 r/min)，取上清液200 μL置于氮?dú)獯蹈傻暮?0 μL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液的具塞離心管中，加入乙酸乙酯-正己烷 (8∶1)800 μL，渦旋2 min，低溫離心10 min(12000 r/min)，取上層有機(jī)相置另一試管中，緩和氮?dú)饬飨麓蹈扇軇瑲堅(jiān)?00 μL甲醇溶解，即得。

2.4.3 腎臟供試品溶液的制備 稱取腎臟相同部位0.5 g，加生理鹽水0.5 mL，10000 r/min勻漿，離心10 min(5000 r/min)，取上清液200 μL置于氮?dú)獯蹈傻暮?0 μL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液的具塞離心管中，加入乙酸乙酯-正己烷 (8∶1)800 μL，渦旋2 min，低溫離心10 min(12000 r/min)，取上層有機(jī)相置另一試管中，氮?dú)饬飨麓蹈扇軇瑲堅(jiān)?00 μL甲醇溶解，即得。

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取內(nèi)標(biāo)溶液20 μL及一定體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液于離心管中，于氮?dú)饬鞔蹈扇軇尤肟瞻籽?00 μL，配制補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素質(zhì)量濃度均為10、6、3、1、0.5、0.1 mg/L的系列血清樣品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下操作，建立血清標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密吸取內(nèi)標(biāo)溶液20 μL及一定體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液于離心管中，于緩和氮?dú)饬鞔蹈扇軇尤肟瞻赘蝿驖{200 μL，配制補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素質(zhì)量濃度均為10、6、3、1、0.5、0.1 mg/L的系列肝臟樣品溶液，按“2.4.2”項(xiàng)下操作，建立肝臟標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密吸取內(nèi)標(biāo)溶液20 μL及一定體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液于離心管中，于氮?dú)饬鞔蹈扇軇尤肟瞻啄I勻漿200 μL，配制補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素質(zhì)量濃度均為10、6、3、1、0.5、0.1 mg/L的系列腎臟樣品溶液，按“2.4.3”項(xiàng)下操作，建立腎臟標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別以各樣品中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)，求得補(bǔ)骨脂素在血清、肝臟、腎臟中的線性回歸方程分別為 Y=1.2467X+0.2028，r=0.9813;Y=1.6294X－0.0372，r=0.9901;Y=1.3354X+0.1379，r=0.9928。異補(bǔ)骨脂素在血清、肝臟、腎臟中的線性回歸方程分別為Y=1.0984X+0.3472，r=0.9916;Y=1.5961X+0.0104，r=0.9924;Y=1.1278X－0.1495，r=0.9926。結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素在0.1～10.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 日內(nèi)日間精密度試驗(yàn) 大鼠空白血清中加入已知量的補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品，分別制成高、中、低質(zhì)量濃度的樣品，按“2.4.1”項(xiàng)下操作，結(jié)果補(bǔ)骨脂素日內(nèi)精密度RSD(n=6)依次為3.62%、3.81%、10.54%，異補(bǔ)骨脂素為3.59%、3.67%、11.04%;補(bǔ)骨脂素日間精密度RSD(n=3)值依次為7.56%、7.07%、11.32%，異補(bǔ)骨脂素為7.34%、7.49%、9.67%。大鼠空白肝勻漿液中加入已知量的補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品，分別制成高、中、低質(zhì)量濃度的樣品，按“2.4.2”項(xiàng)下操作，結(jié)果補(bǔ)骨脂素日內(nèi)精密度RSD(n=6)依次為3.96%、3.72%、10.63%，異補(bǔ)骨脂素為3.79%、4.02%、10.83%;補(bǔ)骨脂素日間精密度 RSD(n=3)依次為6.37%、6.89%、11.24%，異補(bǔ)骨脂素為6.74%、6.97%、10.86%。大鼠空白腎勻漿液中加入已知量的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品，分別制成高、中、低質(zhì)量濃度的樣品，按“2.4.3”項(xiàng)下操作，結(jié)果補(bǔ)骨脂素日內(nèi)精密度RSD(n=6)依次為4.53%、4.62%、11.65%，異補(bǔ)骨脂素為4.38%、4.69%、10.86%;補(bǔ)骨脂素日間精密度RSD(n=3)依次為7.24%、7.58%、12.31%，異補(bǔ)骨脂素為7.85%、8.04%、12.08%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一血清樣品，分別于0、2、6、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)得補(bǔ)骨脂素 RSD為4.59%，異補(bǔ)骨脂素RSD為4.96%，說明該樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 大鼠空白血清中加入已知量的補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品，分別制成高、中、低質(zhì)量濃度的樣品，按“2.4.1”項(xiàng)下操作，結(jié)果平均回收率(n=6)依次為補(bǔ)骨脂素97.84%(3.54%)，93.08%(4.36%)，90.69%(5.21%);異補(bǔ)骨脂素97.12% (3.76%)，93.22%(3.82%)，89.68%(5.47%)。大鼠空白肝勻漿液中加入已知量的補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品，分別制成高、中、低質(zhì)量濃度的樣品，按“2.4.2”項(xiàng)下操作，結(jié)果平均回收率 (n=6)值依次為補(bǔ)骨脂素 98.79% (2.97%)，97.60%(3.52%)，91.25% (4.03%);異補(bǔ)骨脂素97.97%(4.40%)，96.55%(5.86%)，90.71%(5.28%)。大鼠空白腎勻漿液中加入已知量的補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品，分別制成高、中、低質(zhì)量濃度的樣品，按“2.4.3”項(xiàng)下操作，結(jié)果平均回收率(n=6)值依次為補(bǔ)骨脂素96.80%(4.92%)，96.56%(5.09%)，92.30%(5.76%);異補(bǔ)骨脂素98.79%(4.94%)，96.22%(5.29%)，91.34%(5.67%)。結(jié)果表明，該方法切實(shí)可行。

2.9 樣品測(cè)定 精密稱取補(bǔ)骨脂藥材粉末 (過四號(hào)篩)，按3.0 g/kg大鼠灌胃給藥，1 h后眼眶取血，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，制備血清、肝、腎供試品，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各供試品中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的量。結(jié)果，血清中補(bǔ)骨脂素為6.96 mg/L、異補(bǔ)骨脂素為1.67 mg/L;肝臟中補(bǔ)骨脂素為4.98 mg/L、異補(bǔ)骨脂素為0.76 mg/L;腎臟中補(bǔ)骨脂素為2.04 mg/L、異補(bǔ)骨脂素為0.29 mg/L。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了大鼠體內(nèi)補(bǔ)骨脂中主要成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的同時(shí)檢測(cè)方法。采用常用的紫外檢測(cè)器，操作簡(jiǎn)單可行。對(duì)不同色譜柱進(jìn)行了對(duì)比，補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素均達(dá)到了基線分離，分離度良好。實(shí)驗(yàn)中對(duì)血清、肝、腎不同預(yù)處理方法做了初步考察，篩選了不同的萃取溶劑，丙酮、三氯甲烷等回收率低或有干擾，對(duì)不同配比的乙酸乙酯-正己烷進(jìn)行考察，其中乙酸乙酯-正己烷(8∶1)提取效果最好，回收率高。故確定最佳萃取溶劑為乙酸乙酯-正己烷 (8∶1)。

通過預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，空白血清、肝勻漿液、腎勻漿液在補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素相同的保留時(shí)間內(nèi)沒有干擾。但是，如果大鼠有脂肪肝或高脂血癥，則在補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素相同的保留時(shí)間有干擾。因此，在選擇大鼠時(shí)應(yīng)注意檢測(cè)血脂水平。對(duì)不同年齡的大鼠也進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)24月齡大鼠，在補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素相同的保留時(shí)間內(nèi)有干擾，2月齡大鼠沒有干擾。估計(jì)是老齡動(dòng)物的基礎(chǔ)代謝物質(zhì)與青年動(dòng)物不同造成的。對(duì)于雌鼠與雄鼠，預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的代謝速度不一樣，具體差異尚需藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)一步研究。綜上所述，在測(cè)定補(bǔ)骨脂在體內(nèi)分布及代謝時(shí)，應(yīng)選用4月齡左右的大鼠，雌雄各半，同時(shí)給予低脂飼料。

本實(shí)驗(yàn)建立了一種快速分析大鼠體內(nèi)血清、肝、腎中補(bǔ)骨脂藥材有效成分補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量的方法。該方法具有高靈敏度、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，為補(bǔ)骨脂藥代動(dòng)力學(xué)研究以及在體內(nèi)各組織的分布，提供了必要的參考。

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