紫背金盤中痢止蒿甲素、β-蛻皮激素、8-乙酰基哈帕苷的測定

梁曉嵐，易剛強，何桂霞，干 麗，李嘉瀅，李云耀

(湖南中醫藥大學藥學院，湖南長沙 410208)

紫背金盤為唇形科筋骨草屬植物紫背金盤Ajuga nipponensis Makino的全草，又名散瘀草、散血丹，為我國傳統中藥材，具有清熱解毒、涼血散瘀、抗炎消腫止痛之功效。民間常用紫背金盤及其同屬植物治療肺熱咳嗽、咽喉腫痛、癰腫瘡癤及各種炎癥［1-2］。現代藥理作用研究發現紫背金盤還具有解熱、鎮痛、抗炎、抑菌，抗腫瘤，降壓等多種活性［3-9］。其主要化學成分類型有二萜類、環烯醚萜類、甾體酮類［10-11］，紫背金盤中相關成分的定量測定方法尚未見報道。本實驗選取了痢止蒿甲素、β-蛻皮激素和8-乙酰基哈帕苷3種具有顯著藥理作用的成分進行HPLC分析，建立HPLC定量測定方法，為紫背金盤藥材質量控制提供科學依據。

1 儀器與試藥

Agilent1260高效液相色譜儀 (安捷倫化學工作站)、TU-1900雙光束紫外可見分光光度計 (島津儀器有限公司)、分析天平 (島津AUW220D，十萬分之一);紫背金盤采集于湖南省寧鄉縣，批號為20110503、20120507、20130505，經湖南中醫藥大學彭菲教授鑒定為唇形科筋骨草屬植物紫背金盤Ajuga nipponensis Makino的全草，標本存于湖南中醫藥大學中藥化學教研室。藥材常溫下陰干后粉碎，過20目篩，得細粉，備用。痢止蒿甲素、β-蛻皮激素和8-乙酰基哈帕苷對照品由湖南中醫藥大學中藥化學教研室從紫背金盤全草中分離純化所得，經HPLC測定純度大于99%。乙腈為色譜純 (Sigma公司)，水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 SinoChrom ODS-BP色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為25℃，體積流量0.8 mL/min。痢止蒿甲素檢測波長為228 nm，流動相為乙腈-水 (70∶30);β-蛻皮激素檢測波長為243 nm，流動相為乙腈-水 (18∶82);8-乙酰基哈帕苷檢測波長為212 nm，流動相為乙腈-水(13∶87)。痢止蒿甲素、β-蛻皮激素和8-乙酰基哈帕苷對照品在各自色譜條件下分別在19.791、21.762、16.591 min處出峰，樣品中相關檢測對象的色譜峰保留時間均與對照品保留時間一致，且與其他峰分離度好，結果見圖1～圖3。

圖1 痢止蒿甲素對照品 (A)和供試品 (B)HPLC色譜圖Fig.1 Chromatograms of reference substance of ajuforrestin A(A)and sample(B)

圖2 β-蛻皮激素對照品 (A)和供試品 (B)HPLC色譜圖Fig.2 Chromatograms of reference substance of ecdysterone(A)and sample(B)

2.2 對照品溶液制備 精密稱取痢止蒿甲素3.0 mg、β-蛻皮激素 5.0 mg和 8-乙酰基哈帕苷10.0 mg，分別置于25 mL、25 mL、50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即配得0.12 mg/mL的痢止蒿甲素標準液、0.2 mg/mL的β-蛻皮激素標準液和0.2 mg/mL的8-乙酰基哈帕苷標準液，進樣前分別過0.45 μm微孔濾膜即可。

圖3 8-乙酰基哈帕苷對照品 (A)和供試品 (B)HPLC色譜圖Fig.3 Chromatograms of reference substance of 8-o-acetylharpagide(A)and sample(B)

2.3 供試品溶液制備 取紫背金盤藥材粉末3份，每份約取5.0 g，精密稱定，分別置于500 mL圓底燒瓶中，加入50倍量95%的乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液，回收溶劑至干得3份醇提浸膏。取適量甲醇將3份浸膏溶解并分別定容至25 mL、25 mL、100 mL，分別作為痢止蒿甲素、β-蛻皮激素和8-乙酰基哈帕苷的樣品溶液。

2.4 線性關系考察 分別精密吸取質量濃度為0.12 mg/mL的痢止蒿甲素、0.2 mg/mL的β-蛻皮激素和0.2 mg/mL的8-乙酰基哈帕苷對照品2、6、10、14、18、20 μL，按 “2.1”項下的色譜條件分別測定，以色譜峰面積值 (Y)對進樣量 (X，μg)進行線性回歸，得痢止蒿甲素回歸方程為Y=4619.8X+127.43(r=0.9984);β-蛻皮激素回歸方程為Y=2046.7X+13.219(r=0.9962);8-乙酰基哈帕苷回歸方程為Y=246.01X+32.18(r=0.9986)。結果表明，痢止蒿甲素、β-蛻皮激素和8-乙酰基哈帕苷分別在0.24 ～2.40 μg，0.40 ～4.00 μg，0.40 ～ 4.00 μg范圍內線性關系良好。

2.5 精密度試驗 精密吸取一供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣5次，每次20 μL，分別測定其色譜峰面積。痢止蒿甲素、β-蛻皮激素和8-乙酰基哈帕苷峰面積的RSD分別為0.31%、0.54%和0.82%，結果表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗 取同一供試品溶液在0、6、12、18、24 h分別進樣20 μL，測定各成分峰面積。結果6次進樣痢止蒿甲素、β-蛻皮激素和8-乙酰基哈帕苷峰面積的RSD分別為0.41%、0.60%和0.84%，結果表明供試品在24 h內穩定。

2.7 重復性試驗 精密稱取同一批紫背金盤藥材粉末 (批號20130505)6份，按“2.3”項下供試品溶液制備方法，平行制備痢止蒿甲素、β-蛻皮激素和8-乙酰基哈帕苷的樣品溶液各 6份，按“2.1”項下色譜條件，進樣20 μL，測定各成分峰面積的RSD依次為0.42%，0.64%，0.75%，表明本方法重復性良好。

2.8 回收率試驗 精密稱定已知含有量的同一批紫背金盤藥材粉末 (批號20130505)9份，每份約1.0 g，分別加入一定量的對照品溶液，各平行3份，按“2.3”項下供試品溶液制備方法操作，在“2.1”項的色譜條件下，分別進樣20 μL，測定各成分峰面積，計算回收率，結果見表1。

2.9 樣品測定 取3批紫背金盤藥材樣品，按“2.3”項下樣品溶液的配制方法，分別配制痢止蒿甲素、β-蛻皮激素和8-乙酰基哈帕苷的樣品溶液，在“2.1”項的色譜條件下，分別進樣20 μL，測定各成分峰面積并計算，結果見表2。

表2 紫背金盤中痢止蒿甲素、β-蛻皮激素、8-乙酰基哈帕苷的量 (n=3)Tab.2 Content determination of ajuforrestin A，ecdysterone and 8-O-acetylharpagide in Ajuga nipponensis Makino(n=3)

3 討論

3.1 檢測方法的確定 通過用紫外檢測器對痢止蒿甲素、β-蛻皮激素和8-乙酰基哈帕苷的對照品溶液進行全波長掃描，分別在228 nm、243 nm和212 nm處有最大吸收，3個成分沒有共同的較大的吸收波長，故選取228 nm作為痢止蒿甲素的檢測波長，243 nm作為 β-蛻皮激素的檢測波長，212 nm作為8-乙酰基哈帕苷的檢測波長。同時檢測3個成分的方法有待于進一步探索。

3.2 紫背金盤質量控制探討 選取痢止蒿甲素、β-蛻皮激素和8-乙酰基哈帕苷3種具有顯著藥理活性的化學成分，采用高效液相色譜法測定其在紫背金盤藥材中的含有量，方法專屬性較強、重復性好。實驗結果顯示痢止蒿甲素和β-蛻皮激素在藥材中的量相對較低，而8-乙酰基哈帕苷的量較高，達到了0.28%，可考慮將此成分作為紫背金盤藥材鑒定及質量控制的重要指標成分。

［1］吳其浚.植物名實圖考［M］.上海:商務印書館，1957:393-394，445.

［2］蔡光先.湖南藥物志:第7冊［M］.長沙:湖南科學技術出版社，2004:614.

［3］易剛強，李云耀，李曉龍，等.紫背金盤水提物和醇提物解熱作用的研究［J］.湖南中醫藥大學學報，2010，30(11):26-27.

［4］易剛強，陳曉陽，李云耀，等.紫背金盤提取物抗炎鎮痛作用的研究［J］.時珍國醫國藥，2011，22(5):1157-1158.

［5］易剛強，李云耀，李曉龍，等.紫背金盤水提物和醇提物抑菌作用的研究［J］.湖南中醫藥大學學報，2011，31(3):31-32.

［6］謝浙裕，秦明珠，房玉玲.8-乙酰基哈帕苷的藥理作用［J］.國外醫藥植物藥分冊，2005，20(2):56-58.

［7］Takasaki M，Tokuda H，Nishino H，et al.Cancer chemopreventive agents(Antitumor-promoters)from Ajuga decumbens［J］.J Nat Prod，1999，62(7):972-975.

［8］孟 歌，張可杰，張明智.夏枯草的化學成分和抗癌活性研究［J］.西北藥學雜志，2007，22(4):211-213.

［9］王實強，許 敏.筋骨草總二萜的降壓實驗研究［J］.湖南中醫藥導報，1996，2(3):28-29.

［10］中國科學院上海有機化學研究所昆蟲激素組.紫背金盤中植物蛻皮激素的分離和鑒定［J］.化學學報，1981，39(5):466-469.

［11］李衛文，吳文玲，劉守金，等.筋骨草屬植物的化學成分［J］.安徽醫藥，2009，13(3):329-336.