參苓白術(shù)散對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用

李曉冰，崔利宏，陳玉龍，展俊平，謝忠禮，朱艷琴，沈小君，李瑞琴*

(1.河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450008;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700;3.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203)

潰瘍性結(jié)腸炎 (ulcerative colitis，UC)是一種反復(fù)發(fā)作的非特異性炎癥。目前，UC病因及發(fā)病機(jī)制不十分明確，臨床常用糖皮質(zhì)激素和5-氨基水楊酸類(lèi)藥物治療潰瘍性結(jié)腸炎，但此類(lèi)藥物存在嚴(yán)重副作用。新近研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+T細(xì)胞 (regulatory T cell，Treg)在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用，其數(shù)量缺乏或功能缺陷可直接引起人和動(dòng)物多種自身免疫性疾病［1-2］。據(jù)報(bào)道，參苓白術(shù)散以其有效的治療效果和較少的副作用被廣泛應(yīng)用于潰瘍性結(jié)腸炎的治療［3-6］，然而目前對(duì)于其具體機(jī)制的研究并不明了。本實(shí)驗(yàn)建立TNBS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型，應(yīng)用參苓白術(shù)散進(jìn)行治療，揭示Treg在UC小鼠腸道中的變化規(guī)律，探索參苓白術(shù)散對(duì)UC的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 昆明小鼠，雄性，60只，體質(zhì)量18～22 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物許可證編號(hào)為SCXK(冀)2008-1-003。

1.2 藥品與試劑 參苓白術(shù)散購(gòu)于山西華康藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z14020346。地塞米松購(gòu)于武漢遠(yuǎn)大制藥集團(tuán)有限公司。TNBS購(gòu)于Sigma公司;大鼠抗小鼠PE/Cy5-CD4、PE-CD25、AlexaFluor②488-Foxp3抗體，Biolegend公司產(chǎn)品;Foxp3固定破膜試劑盒，eBioseienee公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組及模型制備 實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組，TNBS模型組，參苓白術(shù)散高劑量組，參苓白術(shù)散中劑量組，參苓白術(shù)散低劑量組，地塞米松組。每組10只。除正常對(duì)照組外，乙醚麻醉小鼠，用直徑為1 mm的聚乙烯導(dǎo)管從肛門(mén)插入腸道約3 cm，緩慢注入 TNBS/乙醇溶液0.1 mL(3 mg/mL，40%乙醇)。小鼠被倒置1 min以確保TNBS/乙醇溶液能在腸道均勻分布。給藥后6 h，正常對(duì)照組和TNBS模型組灌胃0.2 mL生理鹽水，每天1次;地塞米松組在造模后1、3、5、7、9 d給予地塞米松 (1 mg/kg，皮下注射)，參苓白術(shù)散溶解于生理鹽水中，參苓白術(shù)散低、中、高劑量組按照0.2 mL藥液體積灌胃，藥物質(zhì)量濃度分別為140、280、560 mg/mL。連續(xù)用藥10 d，造模第11天，處死小鼠。在冰浴條件下取結(jié)腸，測(cè)定結(jié)腸長(zhǎng)度;取腸系膜淋巴結(jié)，測(cè)定調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例;結(jié)腸液氮速凍后轉(zhuǎn)入－80℃保存，以備檢測(cè)結(jié)腸勻漿細(xì)胞因子水平。

1.4 結(jié)腸長(zhǎng)度測(cè)定 處死小鼠后取結(jié)腸測(cè)定結(jié)腸長(zhǎng)度。

1.5 腸系膜淋巴結(jié)Treg細(xì)胞的流式檢測(cè) 取小鼠腸系膜淋巴結(jié)，PBS緩沖液沖洗兩遍，5 mL注射器針芯研磨腸系膜淋巴結(jié)，300目尼龍布過(guò)濾，260×g離心5 min收集細(xì)胞。調(diào)整腸系膜淋巴細(xì)胞密度為5×106個(gè)/mL，取出100 μL，在每個(gè)流式上樣管中加入100 μL準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)約為5×105個(gè)。標(biāo)記抗小鼠PE/Cy5-CD4、PE-CD25抗體，避光4℃孵育30 min。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，旋渦震蕩重懸細(xì)胞后加入1 mL的固定/破膜工作液并再次旋渦混勻，避光4℃孵育30 min。加入2 mL破膜緩沖工作液離心洗滌細(xì)胞并棄去上清液，直接加入稀釋好的熒光標(biāo)記Foxp3抗體5 μL，避光4℃孵育30 min，加入4 mL破膜緩沖工作液離心洗滌細(xì)胞并棄去上清液。0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)并分析。

1.6 細(xì)胞因子測(cè)定 磷酸鈉緩沖液清洗結(jié)腸，處理后的結(jié)腸15000×g離心30 min，收集上清，ELISA法測(cè)定腸組織勻漿上清TNF-α、IL-1β、IL-10水平。

2 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 參苓白術(shù)散減輕TNBS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸長(zhǎng)度縮短 與TNBS模型組比較，參苓白術(shù)散中劑量組能明顯增加潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度 (P＜0.05)，參苓白術(shù)散高劑量組及地塞米松組能顯著升高小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度 (P＜0.01)(如表1)。此組數(shù)據(jù)顯示了參苓白術(shù)散高劑量組在減輕潰瘍性結(jié)腸炎病變程度的潛在作用。

表1 參苓白術(shù)散對(duì)TNBS誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度的影響 (，n=10)

表1 參苓白術(shù)散對(duì)TNBS誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度的影響 (，n=10)

注:與正常組比較，##P＜0.01;與模型組比較，*P＜0.05;＊＊P ＜0.01

/cm正常對(duì)照組組別 動(dòng)物/只 結(jié)腸長(zhǎng)度10 12.34±2.47模型組 10 8.13±1.11##參苓白術(shù)散低劑量組 10 9.17±1.67##參苓白術(shù)散中劑量組 10 9.64±1.74##*參苓白術(shù)散高劑量組 10 10.18±1.25##＊＊地塞米松組 10 11.65±0.96＊＊

3.2 參苓白術(shù)散降低腸黏膜炎性細(xì)胞因子表達(dá) 為檢測(cè)參苓白術(shù)散能否通過(guò)降低腸道炎性細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)揮腸黏膜保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腸道TNF-α和 IL-1β水平，如表2所示，與模型組比較，參苓白術(shù)散高劑量組與地塞米松組能顯著降低腸道IL-1β水平 (P＜0.01)，參苓白術(shù)散高劑量組能顯著降低腸道TNF-α表達(dá) (P＜0.05)。提示參苓白術(shù)散可能通過(guò)降低腸道炎性細(xì)胞因子分泌減輕腸道損傷。

表2 參苓白術(shù)散對(duì)結(jié)腸炎小鼠IL-1β和TNF-α水平的影響(n=10，)

表2 參苓白術(shù)散對(duì)結(jié)腸炎小鼠IL-1β和TNF-α水平的影響(n=10，)

注:與正常組比較，##P＜0.01;與模型組比較，*P＜0.05;＊＊P ＜0.01

組別 動(dòng)物/只IL-1β/(pg·mg －1)TNF-α/(pg·mg －1)10 16.2±3.01 10.8±3.45模型組 10 171.9±22.92## 37±6.21##參苓白術(shù)散高劑量組 10 67.7±15.12##＊＊ 30.3±8.74##*參苓白術(shù)散中劑量組 10 102.9±26.63##＊＊ 31.1±9.64##*參苓白術(shù)散低劑量組 10 115.4±30.29##* 35.5±10.46##地塞米松組 10 20.3±6.18＊＊ 18.6±1.89##＊＊正常對(duì)照組

3.3 參苓白術(shù)散直接影響腸系膜Treg細(xì)胞比例與功能有研究報(bào)道潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病與免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (transforming growth factorβ，TGF-β)降低有關(guān)，CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生IL-10和 TGF-β減輕腸道炎癥狀態(tài)［7-8］。因此，在這部分實(shí)驗(yàn)中，探索了參苓白術(shù)散治療是否可以上調(diào)結(jié)腸組織勻漿中IL-10水平，是否可同時(shí)升高腸系膜淋巴結(jié)Treg細(xì)胞的比例。如表3所示，與正常對(duì)照組比較，TNBS模型組小鼠IL-10明顯降低，而與模型組比較，參苓白術(shù)散高劑量組顯著升高了腸道IL-10水平 (P＜0.01)。為探求參苓白術(shù)散是否通過(guò)調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的比例發(fā)揮治療效應(yīng)，我們檢測(cè)了腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞與CD4+T比值。結(jié)果顯示與模型組比較，參苓白術(shù)散高劑量組明顯提高腸系膜CD4+CD25+Foxp3+T/CD4+T數(shù)值，見(jiàn)表3。

表3 參苓白術(shù)散升高結(jié)腸炎小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例及IL-10水平 (n=10，)

表3 參苓白術(shù)散升高結(jié)腸炎小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例及IL-10水平 (n=10，)

注:與正常組比較，##P＜0.01;與模型組比較，*P＜0.05;＊＊P＜0.01

組 別 動(dòng)物/只 IL-10/(pg·mg－1) (CD4+CD25+Foxp3+T/CD4+T)/%10 193.53±40.16 2.68±0.64模型組 10 75.61±12.34## 1.73±0.36##參苓白術(shù)散高劑量組 10 187.74±36.94＊＊ 2.76±0.32＊＊參苓白術(shù)散中劑量組 10 158.42±15.75#* 2.35±0.28*參苓白術(shù)散低劑量組 10 91.28±24.89## 2.19±0.19#*地塞米松組 10 204.63±46.43＊＊ 3.16±0.57正常對(duì)照組＊＊

4 討論

參苓白術(shù)散出自《太平惠民和劑局方》，被廣泛應(yīng)用于胃腸道疾病的治療。雖然參苓白術(shù)散多年來(lái)應(yīng)用于潰瘍性結(jié)腸炎，但其具體機(jī)制仍不明了。一些研究認(rèn)為其治療作用與提高大鼠結(jié)腸組織SOD活性，降低MDA水平、降低結(jié)腸炎大鼠吞噬細(xì)胞膜糖蛋白及可溶性黏附分子P選擇素有關(guān)［9-10］。然而，參苓白術(shù)散與潰瘍性結(jié)腸炎腸道調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的關(guān)系尚未明了。本研究建立TNBS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型，應(yīng)用參苓白術(shù)散進(jìn)行治療，研究顯示參苓白術(shù)散高劑量組通過(guò)減輕TNBS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸長(zhǎng)度縮短、降低腸黏膜炎性細(xì)胞因子表達(dá)、直接影響腸系膜Treg細(xì)胞比例與功能，調(diào)節(jié)腸道高炎癥狀態(tài)。

IL-1β是炎性腸病進(jìn)展的重要介質(zhì)［11］。IL-1β一方面作為抗炎因子介導(dǎo)UC急性期過(guò)程［12］，在UC發(fā)生的初始階段發(fā)揮重要活性，另一方面，它還可反饋性的促進(jìn)巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2，IFN-γ加速炎癥反應(yīng)。TNF-α主要由活化的單核巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生，可使白細(xì)胞在炎癥局部聚集，刺激單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生細(xì)胞因子，最終導(dǎo)致組織的損傷，在UC中被公認(rèn)為是一種促炎細(xì)胞因子。在UC活動(dòng)期，TNF-α水平升高能介導(dǎo)腸黏膜損傷作用［13］。本實(shí)驗(yàn)中，潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道TNF-α與IL-1β水平均升高，增高的細(xì)胞因子與炎癥細(xì)胞相互作用，加重局部腸黏膜的炎癥損傷。經(jīng)過(guò)參苓白術(shù)散治療，減輕了TNF-α、IL-1β與炎癥細(xì)胞相互作用，減輕局部腸黏膜的炎癥損傷，從而促進(jìn)腸黏膜修復(fù)與潰瘍愈合。

CD4+CD25+Treg對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎有預(yù)防和治療作用，其功能異常或數(shù)量減少均可導(dǎo)致自身免疫性疾病發(fā)生［14］。有效升高Treg比例和加強(qiáng)其功能已經(jīng)成為結(jié)腸炎免疫治療的新策略。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示參苓白術(shù)散高劑量組明顯升高腸系膜淋巴結(jié)Treg細(xì)胞比例，說(shuō)明參苓白術(shù)散可能通過(guò)提高腸道Treg數(shù)量發(fā)揮腸道黏膜保護(hù)作用。調(diào)節(jié)性Treg主要通過(guò)分泌IL-10和TGF-β發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［15-17］。研究表明，由Treg誘導(dǎo)的IL-10升高是結(jié)腸炎治療的有效手段［18］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與正常組比較，TNBS模型組小鼠腸道IL-10水平明顯降低，其趨勢(shì)與Treg細(xì)胞一致，經(jīng)參苓白術(shù)散治療后，腸道IL-10水平水平顯著提高。進(jìn)一步加強(qiáng)了參苓白術(shù)散通過(guò)調(diào)節(jié)腸道黏膜Treg及相關(guān)細(xì)胞因子IL-10發(fā)揮黏膜保護(hù)作用的假設(shè)。同時(shí)，這也解釋了為什么在潰瘍性結(jié)腸炎急性期腸道的高炎癥狀態(tài)，推測(cè)主要是缺乏免疫副調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量及功能的發(fā)揮。而參苓白術(shù)散可能正是加強(qiáng)了免疫副調(diào)節(jié)的力量，所以在應(yīng)用之后，可以顯著降低TNF-α與IL-1β水平。

總之，參苓白術(shù)散通過(guò)提高腸道黏膜Treg細(xì)胞數(shù)量和功能發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道過(guò)度炎癥狀態(tài)，本研究為參苓白術(shù)散治療結(jié)腸炎提供了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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