防己生物堿類成分提取純化工藝研究

楊欣欣，包永睿，王 帥，孟憲生* ，朱瑞卿，朱明香

(1.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧大連 116600;2.遼寧省組分中藥工程技術研究中心，遼寧大連 116600;3.遼寧省現代中藥研究工程實驗室，遼寧大連 116600;4.中國醫科大學，遼寧沈陽 110001)

防己為防己科植物粉防己Stephania tetrandra S.Moore的干燥根，性味苦、寒，歸膀胱、肺經［1］，為我國常用的中藥藥材，主產于浙江、廣東、廣西、安徽、福建等地，具有利水消腫、祛風止痛的功效［2］。防己中的化學成分比較復雜，主要有生物堿、雙黃酮類、揮發油、糖類等，現代藥理學實驗表明生物堿類成分為其主要藥效成分。防己生物堿類成分為多種異喹啉生物堿，其中含有量較高的有粉防己堿、防己諾林堿、輪環藤酚堿、二甲基粉防己堿以及小檗胺等，而粉防己堿和防己諾林堿更為其主要活性成分［3］，《中國藥典》2010年版也將上述兩種成分列為質量控制的主要檢測對象。

隨著對防己化學成分研究的不斷深入，如何將有限的防己資源分離純化成更多、更純的有效成分具有廣泛的經濟和社會效益。防己生物堿類成分的提取、純化工藝已受到越來越多國內外科研人員的關注，但目前關于防己生物堿類成分的提取、純化缺乏系統研究［4-9］，本實驗對防己中生物堿類成分提取和純化工藝進行系統研究，為防己藥材的合理利用及開發奠定實驗基礎。

1 材料

1.1 儀器 LS6150型紫外可見光分光光度計 (TENGAO T＆D);Agilent 1100高效液相色譜儀 (二元泵，DAD檢測器)，ALC.1C.4電子天平 (SALTORIUS GROUP);HSS型電子恒溫水浴鍋 (上海博訊實業有限公司醫療設備廠);CP225D十萬分之一分析天平 (德國Sartorius)。

1.2 藥品與試劑 防己藥材購于大連市開發區成大方圓藥店，經遼寧中醫藥大學翟延君教授鑒定為粉防己Stephania tetrandra S.Moore的干燥根;粉防己堿和防己諾林堿對照品 (供含量測定用，購自中國藥品生物制品檢定所，批號0793-200003、110711-200701);甲醇、冰醋酸 (色譜純，均購于天津市科密歐化學試劑開發中心);乙腈 (色譜純，Mtedia公司)，水為去離子水;其它試劑均為分析純。

2 防己生物堿類成分提取工藝研究

2.1 色譜條件 Agilent-C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為乙腈-甲醇-水-冰醋酸 (40∶30∶30∶1)(每100 mL含十二烷基磺酸鈉0.41 g)［10-11］;檢測波長280 nm;柱溫25℃;體積流量1.0 mL/min。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取粉防己堿和防己諾林堿對照品適量，加甲醇制成防己諾林堿、粉防己堿每1 mL含0.1370 mg、0.1001 mg的對照品溶液。

2.3 單因素水平考察 取防己藥材粉末5 g，精密稱定，分別選用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇溶液加熱回流提取，每次1 h，提取3次，濾過，合并濾液，3000 r/min離心15 min，將上清液濃縮至藥材質量濃度為0.05 g/mL的溶液，測定藥材中粉防己堿和防己諾林堿的量，結果見表1。

表1 不同溶劑提取結果

由表1結果可知，70%乙醇提取溶劑中粉防己堿、防己諾林堿的量均高于其他溶劑，故選用70%乙醇作為防己生物堿的最佳提取溶劑。

2.4 提取條件正交設計試驗 經相關文獻調研和多次預實驗，采用L9(34)正交試驗的方法確定考察因素為提取時間、溶媒量、提取次數，并選定3個水平，用以粉防己堿和防己諾林堿的量為主指標 (權重系數均為0.4)，干膏收率 (權重系數為0.2)為次指標，即綜合指標作為考察指標，優選防己生物堿的最佳提取條件，見表2。

表2 提取條件因素水平

2.5 出膏率試驗和粉防己堿、防己諾林堿的測定 精密稱取防己藥材約5 g(過18目篩)，分別按上述因素水平表進行提取，提取液3000 r/min離心15 min，上清液濃縮成含0.05 g/mL的溶液，用高效液相色譜法進行含量測定。精密吸取上述溶液50 mL，水浴上蒸干 (置已恒重的蒸發皿中)，105℃干燥3 h，冷卻至室溫，迅速精密稱定所得干膏的質量，計算出膏率。

用以藥材中粉防己堿和防己諾林堿的量為主指標 (權重系數均為0.4)，干膏收率 (權重系數為0.2)為次指標，即綜合指標作為考察指標，優選防己生物堿的最佳提取條件，其結果見表3，方差分析見表4。

表3 提取條件正交試驗結果

表4 方差分析

以直觀及方差分析對防己生物堿類成分提取實驗結果進行評價，結果表明，各因素影響大小順序是B＞C＞A，各因素中均沒有顯著差異，因此確定防己生物堿類成分的最佳提取條件為A3B3C2，即8倍量70%乙醇回流提取3次，每次3 h。

2.6 驗證試驗結果 對最佳提取工藝進行驗證試驗，結果表明采用優選的提取工藝條件 (A3B3C2)，粉防己堿、防己諾林堿的量以及出膏率均較高，且工藝穩定，結果見表5。

3 防己生物堿類成分純化工藝研究［12-15］

3.1 樹脂的預處理 選取不同極性的8種型號大孔吸附樹脂一定量，用95%乙醇浸泡24 h，使其充分溶脹，濕法裝柱，用95%乙醇沖洗，洗至流出液與1∶2混合不產生混濁，再用蒸餾水洗，洗至無醇味，備用。

表5 最佳提取工藝驗證

3.2 靜態吸附試驗 準確稱取經預處理的HPD-400、HPD-450、 HPD-100、 D101、 AB-8、 NKA-9、 HPD-300、ADS-7樹脂各1 g，分別置100 mL錐形瓶中，精密加入最佳工藝樣品溶液 (0.4 g/mL)，室溫置水平搖床振搖 (90 r/min)24 h至充分吸附，濾過，測定濾液中粉防己堿、防己諾林堿的量，然后用90%乙醇對上述吸附飽和的樹脂進行解吸 (操作條件同吸附)，測定解析液中粉防己堿、防己諾林堿的的量，結果見表6。

表6 不同型號樹脂的靜態吸附量和解析率測定結果

結果表明，各型號樹脂的吸附量、解吸率相差較大，綜合吸附和解吸兩方面的因素，AB-8型大孔樹脂的吸附量和解吸率均較高，最終確定AB-8樹脂為實驗用防己生物堿類成分純化樹脂。

3.3 泄漏曲線考察 取0.2 g/mL的防己提取液緩緩通過已處理好的AB-8大孔吸附樹脂柱 (樹脂柱床容積約為10 mL，1 BV=10 mL)，體積流量為2 BV/h，收集上樣流出液，每份10 mL，測定每份流出液中粉防己堿、防己諾林堿的量，繪制動態吸附曲線，結果見圖1。結果表明，流出藥液超過60 mL時，即6 BV時，流出液中粉防己堿、防己諾林堿的量顯著增大，說明以粉防己堿、防己諾林堿為代表的生物堿類成分出現明顯泄漏，確定最大上樣量為樹脂柱體積的5倍，故確定即樹脂與上柱量之比為1 g/mL(藥材/濕樹脂)。

圖1 泄漏曲線考察

3.4 解析液考察 吸取防己最佳工藝樣品溶液(0.2 g/mL)，加入已處理好的AB-8大孔吸附樹脂柱中，進行動態吸附，以5 BV水洗脫至無色后，再分別用水、10%、30%、50%、70%、90%乙醇各30 mL解析，體積流量2 BV/h，分別收集解析液，每份30 mL，測定不同質量濃度解析液中粉防己堿、防己諾林堿的量，結果見圖2。結果表明，90%乙醇對粉防己堿、防己諾林堿的量的解析高于其他濃度的解析液，因此確定90%乙醇為最佳解析液。

3.5 解析液用量考察 吸取防己最佳工藝樣品溶液(0.2 g/mL)，加入已處理好的AB-8大孔吸附樹脂柱中，用90%乙醇解析，體積流量2 BV/h，每份10 mL，收集解析液，測定粉防己堿、防己諾林堿的量，結果見圖3。結果表明，當解析液達到8BV時，已基本將粉防己堿、防己諾林堿洗脫干凈，故確定解吸液用量為8 BV。

圖2 解析液的考察

圖3 解析液用量考察

3.6 驗證試驗 取防己樣品液按上述方法選擇的工藝條件進行吸附和洗脫，以粉防己堿、防己諾林堿的量計，總生物堿的純度可達50%。

4 結論與討論

4.1 防己生物堿類成分最佳提取工藝為8倍量70%的乙醇回流提取3次，每次3 h;最佳純化工藝為選用AB-8型號樹脂，3倍柱體積水除雜，8倍量90%乙醇，藥材樹脂用量比1∶1(g/mL)，以粉防己堿、防己諾林堿量計，純化后純度約為50%。

4.2 實驗中所用大孔吸附樹脂可以重復使用，成本低;大孔吸附樹脂操作簡便，溶劑消耗也不大，避免了使用大量有機溶劑進行萃取的步驟，同時也減少了有機溶劑對人體的毒害。大孔吸附樹脂因其操作簡單.快速、高效、低毒的良好性質，使其在中草藥化學成分的提取分離研究中的應用越來越廣泛。現在已有不同類型的大孔吸附樹脂，適用于分離不同性質的化合物。

4.3 本實驗以粉防己堿、防己諾林堿作為定量檢測指標，優選最佳純化工藝與與前期采用紫外分光光度法以總生物堿量作為定量檢測指標實驗結果一致，實驗結果提示該方法準確可靠，可以作為防己生物堿類成分的檢測指標。

4.4 本實驗確定了中藥防己的最佳提取和純化工藝，方法操作簡單，適合實際生產，為防己藥材的合理利用及開發奠定實驗基礎。

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