馬尾松松針總黃酮的閃式提取研究

楊炳川，方應權

(重慶三峽醫藥高等專科學校藥學系，重慶 404020)

馬尾松Pinus massoniana Lamb.為松科Pinaceae植物，是重要的用材樹種和荒山造林的先鋒樹種，也是三峽庫區的主要造林樹種之一，占庫區森林34%，為改善三峽庫區生態環境和土壤質量的發揮了重要作用［1-2］。馬尾松具有很好的藥用價值，松針、松花粉、松節、松香和松黃均可入藥［3-4］。馬尾松松針 (pine needle)系馬尾松的針葉，具有祛風燥濕、解毒止癢、活血安神等功效［3-5］。松針含有揮發油、維生素、莽草素、黃酮類化合物等活性成分［6-7］，其中黃酮類化合物具有抗癌、抗氧化、抗炎、舒張血管、抗病毒、抗菌和抗過敏等多種藥理活性［8］，具有良好的應用前景。

松針總黃酮的提取方法主要有溶劑提取法［6，9］、超聲提取法［10］等，乙醇是常用的提取溶劑。傳統的提取方法不同程度存在溶劑和能量消耗大、提取時間較長等缺點。閃式提取法是近年來應用日漸廣泛的一種中藥提取方法，具有快速高效、節能降耗等優點，可以在瞬間完成有效成分的提取，實驗型閃式提取器約1～2 min即可完成提取，中試型5～10 min完成提取，相比傳統提取方法大大節約了能耗，從而降低生產成本［11-12］。本研究采用閃式提取法提取馬尾松松針中的總黃酮，以正交設計優化提取工藝，為高效合理地利用三峽庫區馬尾松資源提供實驗依據。

1 儀器與材料

JHBE-50S型中草藥閃式提取器 (實驗型，功率1800 W，西安太康生物科技有限公司);RE-5210A旋轉蒸發器 (上海亞榮生化儀器廠);UV760CRT雙光束紫外可見分光光度計 (日本島津);Sartorius BS110S分析天平 (北京賽多利天平有限公司);松針樣品采自長江三峽庫區鐵峰山，由三峽中藥研究所付紹智教授鑒定為馬尾松的松針;蘆丁對照品 (中國食品藥品檢定研究院提供，批號110883—200701);所用試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 閃式提取法提取馬尾松松針總黃酮 取馬尾松松針烘干 (60℃，12 h)，粉碎，制成粗粉 (20目)，精密稱取20 g粗粉置閃式提取罐內，加入12.5倍量 (250 mL)70%乙醇提取110 s，工作電壓為120 V。提取液0.8 μm粒徑濾膜濾過，濾液備用。

2.2 總黃酮的定量測定和提取得率 根據文獻［13-14］，以蘆丁為對照品，采用紫外-可見分光光度法測定總黃酮的量。

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品約10 mg，置50 mL量瓶中，加適量70%乙醇，超聲使溶解，放置至室溫，加70%乙醇至刻度，搖勻，即得質量濃度約為0.2 mg/mL的蘆丁對照品貯備液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取“2.1”項下濾液，加70%乙醇至250 mL，精密吸取2 mL至50 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，即得供試品溶液。

2.2.3 標準曲線的制備 分別精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的對照品貯備液至10 mL量瓶，根據文獻方法［13-14］，分別依次加入 0.3 mL 5%HNO2溶液、0.3 mL Al(NO3)3溶液和4 mL 4%NaOH溶液，每加入一種溶液后均須搖勻并靜置6 min，最后加70%乙醇至刻度，制成質量濃度在0.01～0.05 mg/mL范圍的系列對照品溶液 (n=5)，以相應溶劑為空白，在510 nm波長測定吸收度，得回歸方程A=0.9037C+0.0826，r=0.9998。其中A為吸光度，C為對照品溶液質量濃度。表明蘆丁在0.01～0.05 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.4 精密度 取1.5 mL對照品貯備液置10 mL量瓶中，按“2.2.3”項下條件操作，測定吸光度，連續測定6次，其RSD為0.78%(n=6)，說明儀器精密度較好。

2.2.5 重復性 按“2.2.2”項條件制備供試品溶液6份，精密吸取2.5 mL至10 mL量瓶中，按“2.2.3”項下條件顯色，測定總黃酮含有量，其RSD為1.06%(n=6)，說明方法重復性較好。

2.2.6 回收率 精密稱取已知總黃酮量的松針粗粉20 g置閃式提取罐內，加入對照品溶液適量，按“2.1”項下方法提取總黃酮，按“2.2.2”和“2.2.5”項下條件測定總黃酮的量，重復操作6次，得總黃酮的回收率為96.27%(n=6)。

2.2.7 穩定性 精密吸取供試品溶液2.5 mL，按“2.2.3”項下條件操作，分別在 0、20、40、60、90、120 min時測定吸光度，RSD為0.76%，說明供試品溶液中120 min內穩定。

2.2.8 馬尾松松針提取物總黃酮測定和提取得率 精密吸取供試品溶液2.5 mL至10 mL量瓶，按“2.2.3”項下方法測定吸光度，代入回歸方程計算總黃酮量，并計算提取得率。

2.3 正交試驗優化提取工藝

2.3.1 考察因素和水平 考察了影響閃式提取的工藝參數，根據文獻［11，15］和預試驗結果，本研究確定將松針烘干 (60oC，12h)后制成粗粉 (20目)，以乙醇為提取溶劑，固定工作電壓100V。在此基礎上，以總黃酮得率為指標，考察影響得率的主要因素，即乙醇體積分數 (A)、液料比 (B)和提取時間 (C)，采用L9(34)正交設計表。考察閃提法工藝，因素和水平見表1。

表1 正交試驗因素水平

2.3.2 正交試驗 根據正交設計表各因素和水平的安排(表2)進行試驗，按“2.1”項下方法提取馬尾松松針總黃酮，按“2.2”項下方法測定總黃酮得率，計算極差 (R)，結果見表2。對各因素水平進行方差分析，結果見表3。

表2 正交試驗結果

表3 方差分析

由極差分析可見 (表2)，影響馬尾松松針總黃酮得率的因素主次順序為A＞C＞B，即乙醇體積分數＞提取時間＞液料比。方差分析顯示，因素A(乙醇體積分數)和C(提取時間)對考察指標的影響呈統計學顯著性意義 (P＜0.05)，因素B(液料比)影響不顯著。為使得率最大，選取各因素k值最大時對應的水平，所以，最佳工藝條件應為A3B2C2，即70%乙醇，12.5倍的液料比 (V/m)，閃式提取110 s。

2.3.3 驗證試驗 按最佳工藝條件提取3份各20 g馬尾松松針粗粉，測定吸光度，計算得率。3批供試品的得率分別為3.34%、3.43%和3.32%，平均得率為3.36%，顯示此條件提取得率較高，方法重復性好。

2.4 松針總黃酮提取方法比較 取同一批馬尾松松針粗粉，以文獻報道的方法［9-10］，分別用乙醇回流、超聲提取法提取松針總黃酮，每種方法重復3次，與本研究確定的閃提法相比較，結果見表4。

表4 提取方法比較

3 討論

本研究建立了馬尾松松針總黃酮的閃式提取法，用紫外-可見分光光度法測定提取物中總黃酮的量，并計算得率。以總黃酮得率為指標，采用正交設計優化工藝，得到最佳工藝條件為:將馬尾松松針烘干后制成粗粉 (20目)，工作電壓100 V，以70%的乙醇為提取溶劑，液料比12.5∶1(V/m)，閃式提取時間110 s，提取得率為3.36%，方法簡單可靠，重復性好。

用同一批馬尾松松針樣品，根據文獻報道［9-10］的方法，采用乙醇回流法和超聲提取法提取總黃酮，測定并計算得率，與本研究所建立的閃式提取法相比較。由于文獻中馬尾松松針樣品前處理方法不盡相同，分別采用了陰干、烘干［9］和新鮮松針直接提取［10］的方法，為方便比較，本研究統一采用烘干 (60℃，12 h)后提取的方法比較各種方法的得率。由表4比較溶劑消耗量，閃式提取法∶乙醇回流法∶超聲提取法為1∶2.9∶0.9，即閃式提取法所需溶劑僅為乙醇回流法的約1/3，降低了溶劑用量，這與超聲提取法大致相當。比較提取時間，閃式提取法∶乙醇回流法∶超聲提取法為1∶300∶30，可見閃式提取法大大縮短了工作時間，并相應的降低了耗電量。從總黃酮的提取得率看，乙醇回流法最高，為3.82%，閃提法和超聲法很接近，分別為3.36%和3.48%。

綜合來看，閃提法提取馬尾松松針總黃酮最大的優勢在于縮短提取時間，從而減少能耗;溶劑消耗也少于乙醇回流法，總黃酮得率略低于回流法和超聲提取法。因此，閃式提取法可以作為馬尾松松針總黃酮的一種提取方法。

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