枸杞多糖對2型糖尿病大鼠視網膜炎癥因子表達的影響

魏燕華，成差群，徐建平

(廣東省廣州市荔灣區芳村中醫醫院，廣東 廣州 510361)

糖尿病視網膜病變(DR)是糖尿病微血管病變的并發癥之一，是目前世界范圍內致盲的主要原因之一。傳統醫學稱糖尿病視網膜病變為消渴目病，枸杞對消渴目病的治療功用早有記載。《本草通玄》載:“枸杞子補腎益精，水旺則骨強，而消渴目昏，腰疼、膝痛無不愈矣”。枸杞既能降糖，又能補肝明目、補腎益精可列為首選之品。枸杞多糖(LBP)是從枸杞子中提取而得到的一種天然大分子水溶性多糖，是由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接在一起的多聚物，具有多種生物活性，藥理作用廣泛。王繼紅等[1]通過臨床和動物試驗證實了枸杞對糖尿病視網膜病變有治療作用。炎癥因子的聚集在視網膜病變的發生和發展中均起著重要作用，腫瘤壞死因子－α(TNF－α)等介導的炎性反應在DR的發生、發展及血管并發癥的發病中起到了媒介作用。本研究中觀察了枸杞多糖對血－視網膜屏障炎癥因子TNF－α、白細胞介素－6(IL－6)及C反應蛋白(CRP)水平的影響，探索枸杞多糖對糖尿病視網膜病變保護作用的機理。

1 材料與方法

1．1 儀器、試劑與動物

酶標儀(美國BIO－RAD公司，型號為iMark);血糖儀及試紙(德國羅氏公司，型號為ACCU－CHEK Performa Nano)。鏈脲佐菌素(美國sigma公司，批號為S0130);LBP粉劑(寧夏啟元藥業公司，純度為58．56%，批號為GF03002－l)，用生理鹽水配制成質量濃度為60 g/L的溶液，4℃冰箱貯藏，使用前稀釋至所需濃度;鹽酸二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號為P20110923);大鼠TNF－α酶聯免疫分析試劑盒(R＆D進口分裝，批號為201205);大鼠IL－6酶聯免疫分析試劑盒(R＆D進口分裝，批號為201205);大鼠CRP酶聯免疫分析試劑盒(R＆D進口分裝，批號為 201205)。SD 大鼠，180～220 g，雌雄各半，SPF 級，廣東省醫學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(粵)2009－0004。

1．2 試驗動物模型制備及分組[3]

大鼠適應性飼養3 d，除空白對照組外，其余大鼠給予高糖高脂飼料(在標準全價混合飼料的基礎上添加蔗糖、煉豬油和蛋黃，比例分別為10%蔗糖、10%豬油、5%蛋黃)，喂養5周后，腹腔注射STZ(新鮮配制，溶于0．1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液中，pH為4．5)25 mg/kg，每日1次，連續2 d。空白對照組普通飼料喂養5周，再腹腔注射等量檸檬酸緩沖液，每日1次，連續2 d。注射藥物2 d后間隔1 d，測大鼠空腹血糖(測試前禁食12 h)，以血糖含量16．7 mmol/L為大鼠2型糖尿病模型造模成功的判定標準。將2型糖尿病模型大鼠隨機分為5組，各10只，即2型糖尿病模型組，枸杞多糖高、中、低劑量組[劑量分別為0．6，0．3，0．15 g/(kg·d)]，鹽酸二甲雙胍組[0．25 g/(kg·d)]。于模型復制成功的第2天起，各組大鼠按上述劑量灌胃給藥，空白對照組給予等量生理鹽水，連續給藥2周。

1．3 樣本取材與檢測

藥物治療2周后，大鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，迅速摘取眼球，于手術顯微鏡下沿矢狀切面剖開眼球，棄去眼內容物(房水、玻璃體及晶狀體)，用無齒顯微鑷細心地取出視網膜組織，生理鹽水漂洗2次，再用吸水紙吸干水分，用精密天平稱重后，以pH為7．2的預冷磷酸鹽緩沖液冰浴下制成10%組織勻漿。將組織勻漿液置4℃離心機中，以5 000 r/min的速率離心5 min，取上清。TNF－α，IL－6，CRP濃度均按試劑盒說明書測定。

1．4 統計學處理

2 結果

結果見表1。

表1 枸杞多糖對2型糖尿病模型大鼠視網膜TNF－α，IL－6，CRP濃度的影響(，n=10)

表1 枸杞多糖對2型糖尿病模型大鼠視網膜TNF－α，IL－6，CRP濃度的影響(，n=10)

注:與 2型糖尿病模型組比較，＊P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;與正常對照組比較，▲P ＜0．01。

組別正常對照組2型糖尿病模型組鹽酸二甲雙胍組LBP高劑量組LBP中劑量組LBP低劑量組劑量(g/kg)－ －0．25 0．6 0．3 0．15 TNF－α(ng/L)1．27 ± 0．51 2．80 ± 0．84▲1．81 ± 0．58＊1．36 ± 0．80＊＊2．18 ± 0．83 2．07 ± 0．95 IL－6(ng/L)3．76 ± 0．71 6．70 ± 1．55▲4．09 ± 1．01＊＊4．87 ± 1．47＊4．82 ± 1．33＊5．62 ± 1．45 CRP(mg/L)0．89 ±0．33 1．72 ±0．40▲0．98 ± 0．18＊＊1．15 ± 0．36＊＊1．12 ± 0．25＊＊1．33 ±0．41

3 討論

枸杞是藥食同源的植物，在秦漢時代的《神農本草經》中已有記載，其性甘平質潤，有補益肝腎、明目之功效。LBP為其主要成分，對多種細胞有保護作用，可抗氧化、抑制細胞凋亡[4－6]。何劍鋒等[7]的試驗證明，枸杞對DR有治療作用[7]。但LBP對DR炎癥因子的作用機制的研究國內外少見報道。

DR是糖尿病微血管病變的并發癥之一，是致盲的主要原因之一。長期慢性高糖血癥是其發病基礎，并受全身新陳代謝、內分泌及血液因素等影響。近代研究證實，自由基損傷、周細胞與視網膜血管內皮細胞的凋亡、炎癥因子的聚集與黏附、血液流變學異常、脂代謝障礙在視網膜病變的發生、發展中均起著重要作用。2型糖尿病在臨床治療的過程中，很多患者會出現一定情況的炎癥癥狀，其CRP，TNF－α，IL－6等往往存在異常升高的情況。常規治療對患者的炎癥因子改善并不理想，對血糖的控制情況較差[8]。亞臨床炎癥引起DR的可能機制為2型糖尿病患者非酶糖基化終產物(AGES)增多，與視網膜血管內皮細胞上的AGES受體或配體結合，使其炎癥因子(如TNF－α，IL－6等)，刺激肝細胞產生CRP，并引起局部炎癥，引起血管內皮細胞功能障礙或直接損傷內皮細胞而產生微血管病變。

CRP是急性時相反應蛋白之一，是炎性反應或組織損傷時的非特異性標志物。研究發現，糖尿病患者血清CRP明顯增高，而非糖尿病者則正常，現普遍認為2型糖尿病可能是炎癥因子介導的炎性反應性疾病，并可能導致了胰島B細胞分泌胰島素功能受損及產生胰島素抵抗。在美國進行的大型前瞻性研究證實，CRP是2型糖尿病發病的預測因子，可能在胰島素抵抗和2型糖尿病發病中扮演了重要角色[9]。

TNF－α可直接損傷血－視網膜屏障，提高視網膜血管通透性[10]。TNF－α是介導炎性反應的重要介質，它參與體內的多種病理過程，也是體內炎癥和組織損傷的敏感指標。大量證據表明，TNF－α可能通過增加糖基化酶活性，使中性粒細胞與視網膜內皮細胞黏附性增強[11]。TNF－α可刺激巨噬細胞及其他細胞產生IL－8等，增強視網膜局部炎性反應，促進表皮生長因子(EGF)、血小板源性生長因子(PDGF)等的生成和釋放并協同其增殖作用。這些促生長因子可刺激血管細胞增殖，最終導致眼內新生血管形成。另外，CRP，TNF－α水平增高引起胰島素抵抗也可引起視網膜微血管內皮細胞的病理性增生，與亞臨床炎癥共同作用，引起 DR[12]。

IL－6與內分泌激素、神經遞質及某些效應物質等組成重要的網絡系統，廣泛而精細地調節胰島B細胞的分化、生長和分泌[13]。Carey等[14]對小鼠的研究發現，高血糖可促進胰島細胞分泌IL－6，同時低劑量IL－6又可促進胰島素分泌，高劑量則抑制胰島素分泌。IL－6在糖尿病血管病變中也起重要作用，有報道顯示，糖尿病并動脈粥樣硬化患者普遍存在循環中IL－6水平增高。

本研究結果顯示，2型糖尿病大鼠的視網膜CRP，TNF－α，IL－6水平均升高，表明其可能是DR發生、發展的危險因素。2型糖尿病大鼠視網膜的CRP升高與胰島素抵抗、胰島素敏感性降低及高血糖所致的高IL－6有關，CRP參與急性反應，引起血管內皮功能改變和形態變化影響細胞膜的完整性，使血管內皮的通透性改變，導致DR發生。而高濃度的IL－6可促進胰島B細胞分化產生細胞毒作用，促使胰島B細胞凋亡;IL－6以炎性介質的方式參與糖尿病大鼠DR的發生。另一方面，免疫系統激活產生的炎癥因子TNF－α誘導胰島素抵抗的發生，導致大鼠出現高血糖等變化，從而促進2型糖尿病的發生與發展。經過LBP治療后，不同劑量組的LBP能不同程度地降低2型糖尿病大鼠視網膜CRP，TNF－α，IL－6的濃度水平，其藥理作用呈一定量效關系，并以高、中劑量組效果最好。LBP具有可長期使用而無毒副作用的優點，故探討其生物活性及作用機制具有深遠意義。

綜上所述，LBP具有下調 CRP，TNF－α，IL－6的表達，穩定視網膜屏障上的緊密連接，減少血－視網膜屏障的炎癥因子釋放的作用，從而抑制DR發生與發展。

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