高效毛細(xì)管電泳法分析附子多糖中單糖組分

付 昆，葉 強(qiáng)

(1．四川省成都市第三人民醫(yī)院，四川 成都 610031;2．成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137)

目前，多糖中單糖組成的分析主要采用紙層析、液相色譜、氣相色譜等方法，樣品用量大、試驗(yàn)條件嚴(yán)格，毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)具有樣品用量少、時(shí)間短、靈敏度高、分離效果明顯的特點(diǎn)[1]，主要用于寡糖的分析。多糖的高效毛細(xì)管電泳(HPCE)研究目前尚處于探索階段[2]，由于單糖在水溶液中解離能力極差，在強(qiáng)堿條件下才能帶上電荷。使用含硼砂的緩沖液會(huì)讓單糖在較低的pH條件下帶上足夠的負(fù)電荷。不同的單糖在相同介質(zhì)條件下與硼砂的絡(luò)合物具有有效淌度的差異，足以被毛細(xì)管電泳分辨。單糖的紫外吸收很弱，采用α-萘胺為衍生試劑使其帶上可被檢測(cè)的基團(tuán)[3]。將多糖水解成單糖，再經(jīng)過(guò)和標(biāo)準(zhǔn)單糖相同的處理。用毛細(xì)管電泳分析出其所含單糖的譜圖，與標(biāo)準(zhǔn)單糖的譜圖對(duì)照，即可得出多糖中單糖的種類與含量。本試驗(yàn)中應(yīng)用高效毛細(xì)管電泳對(duì)附子多糖中單糖組成及其含量進(jìn)行測(cè)定，并確定HPCE試驗(yàn)條件。

1 儀器與試藥

P/MDQ型高效毛細(xì)管電泳儀(美國(guó)Beckman公司);32Karasoft操作軟件;石英毛細(xì)管柱(50 μm × 75 cm，Beckman)。半乳糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司);乙醇、丙酮、正丁醇、氯仿、α-萘胺、硼氰化氫鈉、硼砂等其他試劑均為分析純;所用水均為去離子水;附子藥材(四川省中藥飲片有限責(zé)任公司，批號(hào)為110701)。

2 方法與結(jié)果

2．1 多糖樣品制備

2．1．1 提取

干燥附子100 g粉碎后，用8倍量95%的乙醇回流提取2次，每次2 h，抽濾后所得殘?jiān)稍铮尤?倍量水于90℃提取2次，每次15 h，水提液減壓濃縮至200 mL。冷卻后用95%的乙醇調(diào)節(jié)終濃度為80%，密封保存。次日用適量的無(wú)水乙醇、丙酮和石油醚依次抽洗，干燥后得淺褐色附子粗多糖。

2．1．2 純化

除蛋白:多糖25 g溶于50 mL水中，將10 mL的sevage液(氯仿∶正丁醇=4∶1)加入粗多糖液中，劇烈震蕩10 min后，以4 000 r/min的速率離心10 min。除去水相與有機(jī)相間的蛋白，將上層水相反復(fù)操作6次。

脫色:除蛋白后的多糖溶液調(diào)節(jié)pH為8～9，加入10%的H2O2250 mL置4℃冰箱中放置24 h。

透析:透析袋用50%的乙醇蒸制1 h，接著依次用0．01 mol/L的NaHCO3、0．001 mol/L的EDAE和蒸餾水洗滌。將脫色2 d后的多糖溶液裝入處理好的透析袋中，先用自來(lái)水流水透析2 d，然后用流動(dòng)的蒸餾水透析2 d。

醇沉:將透析過(guò)的多糖液經(jīng)70℃減壓濃縮至25 mL，待自然冷卻后加入95%的乙醇調(diào)節(jié)終濃度為80%，次日按上述方法處理得精制后的多糖。

2．2 電泳條件及緩沖液

運(yùn)行緩沖液為 50，75，100 mmol/L 硼砂溶液。pH:9．5，10，10．5;柱溫:25℃;電壓:20 kV;檢測(cè)波長(zhǎng):214 nm;進(jìn)樣氣壓:0．5psi;進(jìn)樣時(shí)間:15 s。清洗液:0．1 mol/L HCL 溶液;0．1 mol/L NaOH 溶液;重蒸水。

2．3 單糖標(biāo)準(zhǔn)品的α-萘胺衍生化[4]

稱取 α-萘胺 143．2 mg和 NaBH3CN 35 mg，溶于450 mL無(wú)水甲醇中，再加入41 mL冰乙酸，置冰箱中待用。取各種單糖用重蒸水配成質(zhì)量濃度為10 g/L的水溶液，各取200 mL，加40 mL衍生試劑置安瓿管中封管，80℃恒溫2 h衍生化。然后各加入三氯甲烷和重蒸水1 mL，反復(fù)離心萃取3次，取上層水相過(guò)濾后定容至5 mL，分別制成各單糖及混合單糖衍生溶液冷藏備測(cè)。

2．4 多糖水解樣品制備

取生附子多糖10 mg，加入2 mol/L H2SO41 mL，封管100℃恒溫水解8 h，冷卻后用碳酸鋇完全中和(pH=7)，放置過(guò)夜，過(guò)濾后取200 mL，按2．3項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化。

2．5 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品測(cè)定

取衍生化的標(biāo)準(zhǔn)品及樣品溶液按2．2項(xiàng)下所示條件測(cè)定遷移時(shí)間和峰面積，分別平行做3份，每份測(cè)3次。根據(jù)各吸收峰的峰面積計(jì)算各單糖組成的相對(duì)比例。

2．6 結(jié)果與分析

硼砂濃度及pH的選定:用硼砂做緩沖液，單糖混合物的分離度隨pH增加而增大，其最佳分離條件為pH=10．5，6種單糖的混合物完全分離。增加緩沖液中的硼砂濃度，能有效地增加分離度，但單糖的出峰時(shí)間亦有所延長(zhǎng)。試驗(yàn)用50 mmol/L時(shí)分離效果不好，在75 mmol/L時(shí)分離效果較好，100 mmol/L時(shí)電流較小，分離效果不好。結(jié)果最終確定硼砂緩沖液濃度為75 mmol/L，pH=10．5。

標(biāo)準(zhǔn)單糖譜圖:將6個(gè)單糖標(biāo)準(zhǔn)品電泳分析，得出各個(gè)單糖的出峰時(shí)間，與混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品譜圖對(duì)照，得出每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單糖的電泳遷移時(shí)間。混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)6個(gè)明顯的峰，得到了有效分離。混合單糖中鼠李糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖的遷移時(shí)間分別為 20．638，24．134，28．665，29．275，31．102，39．927 min。電泳譜圖見(jiàn)圖1(其中峰1為衍生試劑α-萘胺)。

圖1 混合單糖毛細(xì)管電泳圖

多糖樣品分析:將附子多糖作出的譜圖與標(biāo)準(zhǔn)混合單糖譜圖對(duì)照(見(jiàn)圖2)，根據(jù)其出峰時(shí)間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，可確定附子多糖由葡萄糖和半乳糖組成，其比例為 Glc ∶Gal=16．55 ∶28．72。單糖組成有鼠李糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、阿位伯糖、半乳糖，葡萄糖和半乳糖的遷移時(shí)間分別為28．285 min和39．254 min，相對(duì)峰面積分別為16．55%和28．72%。

圖2 附子多糖中單糖毛細(xì)管電泳圖

3 討論

本試驗(yàn)中利用HPCE法檢測(cè)附子多糖單糖組成，取得了較好的分離效果，且操作簡(jiǎn)單、精度高，可發(fā)展為檢測(cè)多糖中單糖組成的一種常用方法[5]。用α-萘胺將糖衍生化，使糖分子的還原端與其反應(yīng)成為Schiff's堿，再利用NaBH3CN還原成仲胺[6]，引入了可供檢測(cè)的基團(tuán)使糖形成硼酸鹽絡(luò)合物，帶上了固有電荷。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，影響HPCE分離效果的主要因素是緩沖液的pH，增加的緩沖液pH可以使糖類的分離度相應(yīng)地增加，但出峰時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng);增加緩沖液濃度，電流變大，峰信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)，選擇75 mmol/L的硼砂溶液分離效果良好。試驗(yàn)結(jié)果表明，附子多糖主要由葡萄糖和半乳糖組成，其比例為Glc∶Gal=16．55∶28．72。

[3]賈國(guó)惠．糖類的高效毛細(xì)管電泳分析[J]．中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2003，23(8):492-493．

[4]耿 越，王暖波．花粉多糖組分的高效毛細(xì)管電泳分析[J]．山東科學(xué)，2001，14(4):10-13．

[5]Nicola V，F(xiàn)rancesca M．Separation of capsular polysaccharide K4 and defructosylated K4 derived disaccharides by fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis(FACE)[J]．Carbohydrate Polymers，2005，61(3):327-333．

[6]張劍波，田庚元．糖類的高效毛細(xì)管電泳[J]．有機(jī)化學(xué)，1998，18(3):88-96．