HPLC法測定不同產地山里紅中表兒茶素含量

★ 邵峰 谷麗菲 劉榮華＊ 黃慧蓮 陳慧娟 江東龍 (江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室 江西南昌330004)

山楂為薔微科山楂屬植物山里紅(Crataegus pinnatifida Bge.var.major.N.E.Br.)或山楂(Crataegus pinnatifida Bge.)的干燥成熟果實，具有消食健胃、行氣散瘀，等功效，臨床常用于治療肉食積滯、胃脘脹滿、瀉痢腹痛、瘀血經閉，等病癥［1］。作為黃烷醇類化合物，表兒茶素具有保護心肌［2］、降血脂［3，4］以及對抗膽酸引起的肝細胞凋亡［5］，等藥效作用。鑒于此，本研究采用HPLC法，對不同產地山里紅中的表兒茶素進行含量測定，為建立山里紅質量控制方法提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國，VWD檢測器，1260化學工作站)，BT25S型十萬分之一電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)，BT5S型萬分之一電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)，N－1001型旋轉蒸發器(東京理化器械(株)獨資工廠)，KQ－300VDB型雙頻數控超聲清洗器(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 表兒茶素對照品(批號:110878－200102)均購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈(色譜純)購自美國Dikma公司，磷酸(分析純)購自西隴化工股份有限公司，雙蒸水(實驗室自制)。

山里紅采集時間為2012年11月，所有藥材經江西中醫藥大學劉榮華教授鑒定，保存于江西中醫藥大學標本館，見表1。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取表兒茶素6.5mg，置于10mL容量瓶中，加入8%甲醇溶液定容至刻度，得到濃度為 0.65mg/mL的對照品母液，經0.22μm微孔濾膜過濾，備用。

2.2 供試品溶液制備 稱取干燥的山里紅樣品100g，經粉碎，加入70%的乙醇500mL，在70℃條件下回流提取3次，每次1h，經過濾，合并濾液，減壓回收溶劑，得到山里紅總提取物。取一定量的的山里紅總提取物置于10mL容量瓶中，加甲醇，超聲提取30min，放置室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，經0.22μm微孔濾膜，得到供試品溶液。

2.3 色譜條件 色譜柱YMC－Triart C18(250mm×4.6mm，5μm);流動相:乙腈(A)～0.4%磷酸溶液(B)，梯度洗脫，0 ～10min，8% ～15%A;10 ～30min，15% ～15%A。流速1mL/min，檢測波長280nm，柱溫25℃，進樣量20μL。理論塔板數大于3000，見圖1。

圖1 山里紅HPLC色譜圖

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 精密吸取溶液濃度分別為0.00166，0.0166，0.083，0.166，0.83，1.00mg/mL 表兒茶素對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件測定峰面積。以進樣濃度(mg/mL)為橫坐標(X)，色譜峰面積為縱坐標(Y)，得標準曲線，建立表兒茶素回歸方程，即 Y=11741X － 12.712，r=0.9993，在0.00166～1.00mg/mL范圍內呈良好線性關系。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取表兒茶素對照品溶液20μL，按“2.3”項下色譜條件，連續進樣6 次，計算峰面積的RSD為0.043%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，按“2.2”項方法制備供試品溶液及“2.3”項下色譜條件，分別在第0，2，4，6，8，10h 間隔進樣 20μL，測得表兒茶素峰面積積分值，計算供試品 RSD為1.92%，表明樣品在10h內穩定性良好。

2.4.4 重復性試驗 取同一產地山里紅樣品，按“2.2”項方法制備供試品溶液 6份及“2.3”項下色譜條件，進樣20μL，測得表兒茶素的峰面積積分值，計算供試品RSD為2.51%，表明樣品制備方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收試驗 取已知表兒茶素含量的山東省臨沂市沂水縣產山里紅藥材6份，每份1.0g，精密稱定，按“2.2”項方法制備供試品溶液，加入適量的表兒茶素對照品，按“2.3”項下色譜條件進樣20μL，測定表兒茶素含量并計算回收率，見表2。

2.4.6 樣品含量測定 精密吸取已制備的不同產地山里紅待測溶液各20μL，注入液相色譜儀，測定表兒茶素峰面積積分值，利用外標法分別計算表兒茶素的含量，結果表明:山里紅中表兒茶素含量在0.04% ～0.21%范圍內，其中，山東省青州市出產的山里紅含量最高，山西省運城市絳縣出產的山里紅含量最低。見表3。

表2 表兒茶素加樣回收率測定

表3 不同產地山里紅中表兒茶素含量測定(n=3)

3 討論

生物體內的氧自由基在心血管疾病的發生與發展方面起著重要的作用。本課題組曾研究發現，山楂葉中的表兒茶素對于羥自由基和過氧化氫具有較強的清除活性［6］。鑒于此，本研究在以往相關文獻報道的基礎上［7－9］，采用 HPLC 定量分析技術，建立山里紅中表兒茶素含量測定的方法。該方法操作簡單，準確，重復性好，易于推廣。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典﹒一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:29.

［2］曹瑩，梁日欣，楊濱，等.(－)－兒茶素沒食子酸酯和(+)－表兒茶素對心肌細胞保護作用研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2006，12(10):36 －38.

［3］林親錄，施兆鵬，劉湘新，等.兒茶素和表兒茶素對動物血脂的影響［J］.中國食品學報，2002，2(3):16 －20.

［4］劉湘新，林親錄，施兆鵬，等.兒茶素和表兒茶素對小白鼠血清脂質的影響［J］.湖南農業大學學報(自然科學版)，2002，28(3):232－233.

［5］余晶，Vladim ir Khaoustov，徐玉敏，等.表兒茶素對牛磺酸脫氧膽酸誘導Huh7細胞凋亡的作用［J］.中國中藥雜志，2009，34(10):1 272－1 275.

［6］劉榮華，陳蘭英，朱根華，等.單籽山楂葉中多元酚類成分及其抗氧化活性研究［J］.中草藥，2007，38(10):1 541 －1 544.

［7］劉建利，原江鋒，閻娥，等.山楂多分含量的反相高效液相色譜法測定［J］.食品科學，2009，30(14):163 －166.

［8］陳承瑜，楊濱，周潔.山楂飲片的質量評價研究［J］.中國實驗方劑學，2009，15(12):1 －3.

［9］章弘揚，張弛，王月榮，等.山楂中黃酮類成分的定性和定量分析［J］.中國中藥雜志，2012，37(5):601 －604.