水稻種子酵母雙雜交體系的構建及種子特異表達蛋白ONAC023互作蛋白的鑒定

唐立群++黃世文++侯雨萱

摘要：酵母雙雜交是常用的蛋白-蛋白檢測技術。以水稻受精5 d的幼嫩種子為材料，構建了適用于水稻種子發育相關蛋白的互作蛋白酵母雙雜交篩選平臺，cDNA文庫容量達到1.1×106，平均插入大小約為750 bp，開發了改良的酵母菌落PCR方法，用于文庫插入片段的擴增，大大提高了篩選效率。NAC是植物特有的一類轉錄因子，在植物發育、抗逆等多個方面發揮著重要功能。RT-PCR結果顯示，NAC家族成員ONAC023在種子中特異表達，可能調控種子早期發育。以ONAC023為誘餌，成功地篩選到21個互作蛋白候選基因，其中包含1個DNA linding protein，推測其可能是ONAC023蛋白復合物的成員。

關鍵詞：水稻；酵母雙雜交；種子發育；NAC

中圖分類號： S511.035.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0016-04

收稿日期：2014-05-07

基金項目：國家科技支撐計劃（編號：2012BAD19B03）；國家轉基因生物新品種培育專項（編號：2011ZX08010-005）；中國農業科學院科技創新工程。

作者簡介：唐立群（1987—），女，湖南東安人，碩士，從事水稻基因功能研究。E-mail：liquntang2013@126.com 。

通信作者：候雨萱，博士，助理研究員，從事水稻基因功能研究。E-mail：houyuxuan@caas.cn。真核生物中的大部分蛋白都是以復合物的形式存在并工作。一些蛋白在不同的生長發育時期通過與不同的蛋白互作，形成蛋白復合物來行使不同的生物學功能，從而保證生物體高效運行。研究蛋白-蛋白之間的互作，進而找出功能蛋白復合物的其他成員，一直是生物學研究的重要內容。目前，常用的研究蛋白-蛋白互作的方法有酵母雙雜交、免疫共沉淀、GST pull-down、雙分子熒光互補等技術，其中以酵母雙雜交方法應用最為廣泛。 酵母雙雜交技術最早于1989年由Fields提出，其基本原理是酵母轉錄因子GAL4具有BD、AD 2個結構域，BD與AD單獨作用并不能激活轉錄反應，但當二者在空間上充分接近時，則呈現完整的GAL4轉錄因子活性并可激活UAS下游啟動子，使啟動子下游基因得到轉錄。因此，將要檢測互作的2個蛋白分別與BD、AD融合表達，當這2個蛋白存在互作時，BD才能與AD在空間上靠近，進而激活下游報告篩選基因的表達。相比其他蛋白互作檢測技術，酵母雙雜交具有眾多優點：快速高效，無需提取或純化目標蛋白質；在酵母活體內進行，一定程度上代表了真核生物細胞的活體狀態；檢測的結果可以是基因表達產物的積累效應，因而可檢測存在于蛋白質之間的微弱或暫時的相互作用。此外，通過構建所需組織器官的酵母雙雜交篩選文庫，研究人員可以一次性篩選多個與“誘餌”互作的蛋白 。目前，已有大量的商業化酵母雙雜交系統試劑盒可供選擇，其中Clontech公司最新的Make Your Own “Mate & PlateTM” Library System因具有高效、簡單、易操作的特點而被廣泛使用。這一體系運用該公司特有的SMART cDNA合成技術在合成的cDNA兩端添加重組位點接頭，然后將合成的cDNA與線性化的載體共轉化到酵母菌株Y187中完成體內重組，得到酵母雙雜交cDNA文庫。該體系的另一個特點是利用酵母不同菌株的交配（mating）技術來篩選文庫，操作簡單易行。Kanneganti等在研究水稻基因家族與脅迫相關的蛋白基因OsiSAP8功能時，發現其功能由A20、AN1這2個鋅指域相互作用而對水稻生理功能進行調控[1]。Menke等運用酵母雙雜法研究煙草轉錄因子WRKY1功能，結果表明，其與煙草HR-like細胞的死亡密切相關[2]。崔紅軍等在研究玉米的根部基因功能時也提及了這一技術[3]。轉錄因子是一群能與基因5′端上游特定序列專一性結合，從而保證目的基因以特定的強度在特定的時間與空間表達的蛋白質分子。轉錄因子依據結構域的保守性可區分為數百個不同的家族，在生物體的生長發育過程中起著重要的調控作用。NAM、ATAF、CUC （NAC）類轉錄因子是一類植物特有的家族，其所有成員在N端都含有1個保守的DNA結合結構域，在C端則各不相同[4-7]。目前，關于NAC轉錄因子的功能研究已有大量報道[8-9]。Zhu等研究發現，番茄的SINAC4調控果實的成熟及類胡蘿卜素的沉積[10]。Hu等發現，SNAC1可以通過調控水稻保衛細胞的閉合來提高植株的耐旱性，可能是干旱反應的關鍵調控因子[11]。過量表達SNAC1還能提升小麥、棉花的抗逆性[12]。水稻是我國主要的糧食作物，開展水稻基因功能研究，了解水稻內部各個基因、基因與外界的互作關系，對于保障國家糧食安全意義重大。本研究利用改良的種子RNA提取方法得到高質量的總RNA，采用Make Your Own“Mate & PlateTM” Library System建立來源于水稻種子的酵母雙雜交體系，成功篩選到1個種子中特異表達的NAC轉錄因子ONAC023的互作蛋白。

1材料與方法

1.1材料

水稻品種日本晴種植于中國水稻研究所試驗田，取受精 5 d 的種子作為材料。酵母菌株Y187與Y2HGold以及載體pGBKT7、pGADT7-Rec、Make Your Own “Mate & PlateTM” Library System、YeastmakerTM Yeast Transformation System 2均購自Clontech 公司。RNA提取試劑Trizol購自上海鼎國生物技術有限公司。

1.2RNA的提取和反轉錄

取自然受精5 d的種子，采用SDS-Trizol法抽提總RNA，簡要步驟如下：將200 mg種子材料置于1.5 mL離心管中，加300 μL SDS RNA extraction buffer （50 mmol/L pH值為8.0 Tris-HCl，150 mmol/L LiCl，5 mmol/L EDTA，1% SDS），用塑料研磨棒磨成勻漿后，加入等體積苯酚 ∶氯仿（1 ∶1）混合液抽提，取上清加入1 mL Trizol抽提RNA。總RNA樣品用 2 μL DNAaseI（寶生物大連工程有限公司）37 ℃處理 30 min 后熱滅活。用NanoDrop2000分光光度計測量RNA的 D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm值及濃度，電泳檢測RNA的質量。RT-PCR所用cDNA的反轉錄方法參照ReverTra Ace qPCR RT 的試劑盒說明書[東洋紡（上海）生物科技有限公司]。

1.3酵母雙雜交cDNA文庫的構建

取2 μg RNA為模板，參照Clontech試劑盒的要求，反轉錄成雙鏈cDNA，LD-PCR擴增雙鏈cDNA，并用CHROMASPINTM TE-400Column純化，去除小于400 bp的片段。將5 μg cDNA與3 μg pGADT7rec 載體參照YeastmakerTM Yeast Transformation System 2試劑盒的要求轉入酵母Y187菌株中。經SD/-Leu平皿篩選獲得陽性轉化子，再用freezing medium 收集菌體，得到freezing medium 酵母懸浮液，將文庫的懸浮液分裝在2 mL無菌離心管中，置于-80 ℃冰箱中長期保存。

1.4文庫插入片段檢測

在上述SD/-Leu平板上隨機挑取30個單菌落，再用YPDA液體培養基擴大培養，最后采用改良的酵母菌落PCR方法檢測插入片段的大小分布，具體步驟如下：取200 μL酵母培養液，離心收集菌體后加入45 μL sorbitol buffer 及 5 μL Zymolyase （上海索萊寶生物科技有限公司），懸浮菌體后 37 ℃ 處理2 h，然后加入150 μL去離子水稀釋，95 ℃處理 20 min，再置于冰上冷卻5 min，取1 μL產物作為模板，用引物PGADf、PGADr進行PCR擴增，檢測文庫插入片段的大小（引物序列分別為PGADf：5′-CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3′；PGADr：5′-GTGAACTTGCGGGGTTT TTCAGTATCTACGAT-3′），反應體系為：1×KOD Fx buffer，05 mmol/L dNTP 2.5 μL，正反引物各0.1 μmol/L，KOD Fx enzyme 2 U，去離子水補足總體積至50 μL。擴增條件為：95 ℃ 預變性 5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，68 ℃延伸3 min，擴增35個循環；68 ℃延伸5 min。反應結束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5ONAC023/pGBKT7載體的構建及酵母轉化

以水稻種子cDNA為模板，用YONAC023f、YONAC023r引物擴增出ONAC023的759 bp完整編碼序列（YONAC023f：5′-CGGAATTCATGGCGATGACACCGCAGCT-3′；YONAC02 3r：5′-CGGGATCCCTAGCCACCATGGTTTCTTT-3′），PCR產物純化后經EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切，連接克隆到pGBKT7載體上。將測序驗證后的載體質粒按YeastmakerTM Yeast Transformation System 2試劑盒的要求轉入到酵母Y2HGold菌株中，經SD/-Trp篩選，采用“1.4”中所述酵母菌落PCR方法驗證陽性克隆。

1.6酵母雙雜交文庫的篩選和互作蛋白基因的測定

參照Clontech公司MatchmakerTM Gold Yeast Two-Hybrid System的說明書完成文庫和誘餌蛋白ONAC023/pGBKT7的交配，酵母雜合子懸浮在10 mL 0.5×YPDA培養基中，取 1 μL 懸浮液稀釋后涂在SD/-Leu/-Trp培養基中用于計算篩選效率，其余雜合子酵母菌全部涂在含250 ng/mL Aba的 SD/-Leu/-Trp 培養基上，對于初篩得到的陽性克隆重新轉移到含250 ng/mL Aba及40 μg/mL x-α-Gal的 SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/ 培養基上進一步篩選，能在 4 d 內長出并顯藍色的單菌落即為互作的陽性克隆。采用“1.4”所述的酵母菌落PCR方法擴增出互作蛋白的基因序列，純化后用T7引物測序即可得到基因序列。

2結果與分析

2.1來源于水稻種子cDNA文庫的構建

采用SDS-Trizol抽提受精5 d的水稻種子總RNA，此法能有效去除淀粉、儲藏蛋白等雜質，提高抽提RNA的質量。由D260 nm/D280 nm=1.86、D260 nm/D230 nm=1.91可知，抽提的RNA質量較好，沒有產生降解以及多聚糖的污染。圖1是總RNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳，可見水稻種子的3條帶比較清晰，沒有出現擴散、拖尾等降解情況，且28S條帶明顯比18S條帶亮，進一步確定RNA質量適合文庫的反轉錄要求。水稻種子總RNA反轉錄為單鏈cDNA，再以單鏈cDNA為模板合成雙鏈cDNA，再將此cDNA過Chromaspin TE-400Column柱子純化，除去雜質、小片段cDNA。由圖2可知，純化前cDNA的一些小片段已被有效去除。將純化后的雙鏈cDNA與載體pGADT7-Rec共轉化到酵母感受態細胞中完成體內同源重組。將1 μL轉化子分別稀釋10、100、1 000倍并涂在 SD/-Leu 平皿上，統計平板培養基上的酵母菌落數量（圖 3），結果表明，文庫的容量為1.1×106庫的容量，轉化結果較理想，可以滿足下一步酵母雙雜篩選的需要。為了檢測文庫插入片段的大小及重復性，筆者隨機挑取30個文庫轉化子，通過酵母菌落PCR反應檢測文庫插入片段大小。電泳結果顯示，插入片段平均大小約750 bp（圖4）。

2.2ONAC023是一個種子特異表達轉錄因子

通過對水稻140個NAC基因家族成員的公共表達譜數

據進行分析，筆者發現了1個種子特異表達轉錄因子ONAC023（圖5）位于水稻2號染色體上，基因座 LOC_Os02g12310 包含2個外顯子、1個內含子，CDS全長 759 bp。NCBI上的conserved domain檢索顯示，12～143位氨基酸是一個保守的NAM結構域。為了驗證ONAC023的種子特異表達模式，筆者分別以愈傷、根、莖、葉、葉鞘、幼穗、受精3 d種子、受精7 d種子、受精15 d種子的cDNA為模板，進行 RT-PCR 擴增檢測其時空表達模式。如圖6所示，ONAC023僅在種子中表達，其中在受精3 d時表達量最高，在受精15 d的種子中最為微弱，在其他組織中并沒有檢測到擴增信號。因此筆者認為，ONAC023是一個種子特異表達的NAC類轉錄因子，這樣的表達模式也暗示著ONAC023可能在種子發育的早期行使重要功能。

2.3ONAC023互作蛋白的篩選

為了驗證ONAC023是否存在自激活，將構建好的BD-ONAC023與pGADT7空載體轉化到Y2HGold菌株中。結果顯示，BD-ONAC023與pGADT7成功共轉化的菌落并不能在含有Aba（250ng/mL）的QDO培養基上存活，表面ONAC023不存在自激活特性。采用酵母交配（mating）的篩選策略，筆者將表達BD-ONAC023誘餌蛋白的Y2HGold菌株以及包含種子cDNA文庫的Y187菌株混合培養24 h，再將酵母雜合子均勻涂布在SD/-Leu/-Trp/Aba（250 ng/mL）平皿上，進行第1輪初篩選，初篩選共得到97個陽性單菌落。為驗證初步篩選結果，每個陽性單菌落被挑到更高篩選壓的 SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/Aba（250 ng/mL）/X-α-Gal平皿上進行篩選，能夠在2 d內長出顯藍色的菌落即被認為是與ONAC023互作的陽性克隆，生長速度與藍色深淺則作為互作強度的判斷依據。第2輪高壓篩選排除61個假陽性克隆（圖7）。為了得到這些互作蛋白的基因序列，筆者采用酵母菌落PCR方法擴增出cDNA片段。擴增帶型一致的克隆被認為是同一基因，只挑選其中1個，將PCR產物純化后進行測序。經Blast序列比對，最終篩選到21個與ONAC023互作的蛋白基因，具體基因ID及功能注釋如表1所示。這些互作的蛋白包括儲藏蛋白質如谷蛋白、Cupin蛋白，具有分子伴侶功能的異構酶peptidyl-prolyl cis-trans isomersae以及一些與代謝相關的酶類，如烯醇酶Enolase、乙醇脫氫酶等。

3結論與討論

高質量的RNA是構建cDNA文庫的第一步，直接影響文庫構建的質量。因發育的種子中含有大量的淀粉及儲藏蛋白質，采用常規的Trizol法分離得到的RNA往往含有大量的多糖及蛋白成分，多糖與RNA被乙醇共沉淀后影響RNA的溶解及后續的克隆操作。本研究采用改良的SDS-Trizol法，利用SDS和酚仿混合物多次抽提，去除大量的淀粉、蛋白污染，然后再沿用傳統的Trizol法提取得到純凈的RNA，可以用于各種分子克隆操作。作為廣泛使用的蛋白-蛋白互作研究方法，酵母雙雜交是一項常規性的操作[13-14]。本研究在商業化

試劑盒的基礎上，對操作程序進行了優化。對于陽性克隆的基因序列進行測定，商品化試劑盒推薦的是從陽性雜合子菌落中提取質粒，然而因其拷貝數低、酵母破壁困難等因素，從酵母中一般只能得到微量的質粒，無法滿足測序所需。因此，要將酵母中提取到的質粒重新轉化到大腸桿菌中繁殖，以期得到測序所需的模板量，這一操作流程需要4～5 d，費時費力。本研究重新設計了特異的載體多克隆位點兩段的引物序列，利用改良的酵母菌落PCR方法，以陽性克隆的酵母菌落為模板，直接擴增出基因序列，PCR產物純化后直接用T7引物測序即可，一般在12 h內可以完成全部擴增及純化流程，大大提高了效率。在酵母菌落PCR操作過程中，發現某些傳統的酵母破壁方法如沸水加熱破壁、SDS破壁以及單純的破壁酶都不具備良好的重復性。破壁酶結合加熱破壁可以有效破除酵母細胞壁，確保質粒釋放到溶液中。本研究還將破壁后的反應液稀釋數倍以減少酵母破壁后一些次生代謝物的影響。RT-PCR結果顯示，ONAC023在種子中特異表達，且在種子發育的早期表達量要高于后期。通過對水稻早期種子的cDNA酵母雙雜交文庫進行篩選，本研究尋找到21個可能與ONAC023互作的蛋白，包括儲藏蛋白質如谷蛋白、Cupin蛋白，分子伴侶以及一些與代謝相關的酶類，其中1個DNA binding蛋白（LOC_Os05g01050）與ONAC023有強烈互作。LOC_Os05g01050編碼1個含有135個氨基酸的蛋白，其中 46～106 位氨基酸是一個保守的DNA binding結構域，可能具有轉錄因子的特性。已有大量報道顯示，轉錄因子一般都是通過與多個蛋白形成復合物來啟動下游基因的轉錄，如 NF-Y 類轉錄因子就是與其他2個轉錄因子以異源三聚體復合物的形態工作[15]。因此，我們推測LOC_Os05g01050可能是ONAC023蛋白復合物的成員。公共表達譜數據庫檢索發現，LOC_Os05g01050是一個組成型表達的基因，其功能尚無報道。本研究結果為研究ONAC023在種子發育中的功能奠定了堅實的基礎，尤其是具有轉錄因子特性的DNA binding蛋白LOC_Os05g01050將是研究的重點。但考慮到酵母雙雜交結果存在假陽性的缺點，仍需要其他獨立的蛋白-蛋白互作技術，如免疫共沉淀或GST pull down等來進一步驗證這些互作結果。

參考文獻：

[1]Kanneganti V，Gupta A K. Overexpression of OsiSAP8，a member of stress associated protein （SAP） gene family of rice confers tolerance to salt，drought and cold stress in transgenic tobacco and rice[J]. Plant Molecular Biology，2008，66（5）：445-462.

[2]Menke F L，Kang H G，Chen Z X，et al. Tobacco transcription factor WRKY1 is phosphorylated by the MAP kinase SIPK and mediates HR-like cell death in tobacco[J]. Molecular Plant-microbe Interactions：MPMI，2005，18（10）：1027-1034.

[3]崔紅軍，張軍杰，黃玉碧. 玉米根部酵母雙雜交cDNA文庫的構建及評價[J]. 分子植物育種，2008，6（1）：161-164.

[4]Xie Q，Frugis G，Colgan D，et al. Arabidopsis NAC1 transduces auxin signal downstream of TIR1 to promote lateral root development[J]. Genes & Development，2000，14（23）：3024-3036.

[5]Duval M，Hsieh T F，Kim S Y，et al. Molecular characterization of AtNAM：a member of the Arabidopsis NAC domain superfamily[J]. Plant Molecular Biology，2002，50（2）：237-248.

[6]Ernst H A，Olsen A N，Larsen S，et al. Structure of the conserved domain of ANAC，a member of the NAC family of transcription factors[J]. EMBO Reports，2004，5（3）：297-303.

[7]Olsen A N，Ernst H A，Leggio L L，et al. NAC transcription factors：structurally distinct，functionally diverse[J]. Trends in Plant Science，2005，10（2）：79-87.

[8]Souer E，Vanhouwelingen A，Kloos D，et al. The no apical meristem gene of petunia is required for pattern formation in embryos and flowers and is expressed at meristem and primordia boundaries[J]. Cell，1996，85（2）：159-170.

[9]Aida M，Ishida T，Fukaki H，et al. Genes involved in organ separation in Arabidopsis：an analysis of the cup-shaped cotyledon mutant[J]. The Plant Cell，1997，9（6）：841-857.

[10]Zhu M，Chen G，Hu Z，et al. A new tomato NAC （NAM/ATAF1/2/CUC2） transcription factor，SlNAC4，functions as a positive regulator of fruit ripening and carotenoid accumulation[J]. Plant Cell Physiol，2014，55：119-135.

[11]Hu H H，Dai M Q，Yao J L，et al. Overexpressing a NAM，ATAF，and CUC （NAC） transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103（35）：12987-12992.

[12]Saad A S，Li X，Li H P，et al. A rice stress-responsive NAC gene enhances tolerance of transgenic wheat to drought and salt stresses[J]. Plant Science：an International Journal of Experimental Plant Biology，2013，203-204（204）：33-40.

[13]Moon Y H，Kang H G，Jung J Y，et al. Determination of the motif responsible for interaction between the rice APETALA1/AGAMOUS-LIKE9 family proteins using a yeast two-hybrid system[J]. Plant Physiology，1999，120（4）：1193-1203.

[14]Singh R，Lee M O，Lee J E，et al. Rice mitogen-activated protein kinase interactome analysis using the yeast two-hybrid system[J]. Plant Physiology，2012，160（1）：477-487.

[15]Petroni K，Kumimoto R W，Gnesutta N，et al. The promiscuous life of plant NUCLEAR FACTOR Y transcription factors[J]. The Plant Cell，2012，24（12）：4777-4792.

[4]Xie Q，Frugis G，Colgan D，et al. Arabidopsis NAC1 transduces auxin signal downstream of TIR1 to promote lateral root development[J]. Genes & Development，2000，14（23）：3024-3036.

[5]Duval M，Hsieh T F，Kim S Y，et al. Molecular characterization of AtNAM：a member of the Arabidopsis NAC domain superfamily[J]. Plant Molecular Biology，2002，50（2）：237-248.

[6]Ernst H A，Olsen A N，Larsen S，et al. Structure of the conserved domain of ANAC，a member of the NAC family of transcription factors[J]. EMBO Reports，2004，5（3）：297-303.

[7]Olsen A N，Ernst H A，Leggio L L，et al. NAC transcription factors：structurally distinct，functionally diverse[J]. Trends in Plant Science，2005，10（2）：79-87.

[8]Souer E，Vanhouwelingen A，Kloos D，et al. The no apical meristem gene of petunia is required for pattern formation in embryos and flowers and is expressed at meristem and primordia boundaries[J]. Cell，1996，85（2）：159-170.

[9]Aida M，Ishida T，Fukaki H，et al. Genes involved in organ separation in Arabidopsis：an analysis of the cup-shaped cotyledon mutant[J]. The Plant Cell，1997，9（6）：841-857.

[10]Zhu M，Chen G，Hu Z，et al. A new tomato NAC （NAM/ATAF1/2/CUC2） transcription factor，SlNAC4，functions as a positive regulator of fruit ripening and carotenoid accumulation[J]. Plant Cell Physiol，2014，55：119-135.

[11]Hu H H，Dai M Q，Yao J L，et al. Overexpressing a NAM，ATAF，and CUC （NAC） transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103（35）：12987-12992.

[12]Saad A S，Li X，Li H P，et al. A rice stress-responsive NAC gene enhances tolerance of transgenic wheat to drought and salt stresses[J]. Plant Science：an International Journal of Experimental Plant Biology，2013，203-204（204）：33-40.

[13]Moon Y H，Kang H G，Jung J Y，et al. Determination of the motif responsible for interaction between the rice APETALA1/AGAMOUS-LIKE9 family proteins using a yeast two-hybrid system[J]. Plant Physiology，1999，120（4）：1193-1203.

[14]Singh R，Lee M O，Lee J E，et al. Rice mitogen-activated protein kinase interactome analysis using the yeast two-hybrid system[J]. Plant Physiology，2012，160（1）：477-487.

[15]Petroni K，Kumimoto R W，Gnesutta N，et al. The promiscuous life of plant NUCLEAR FACTOR Y transcription factors[J]. The Plant Cell，2012，24（12）：4777-4792.

[4]Xie Q，Frugis G，Colgan D，et al. Arabidopsis NAC1 transduces auxin signal downstream of TIR1 to promote lateral root development[J]. Genes & Development，2000，14（23）：3024-3036.

[5]Duval M，Hsieh T F，Kim S Y，et al. Molecular characterization of AtNAM：a member of the Arabidopsis NAC domain superfamily[J]. Plant Molecular Biology，2002，50（2）：237-248.

[6]Ernst H A，Olsen A N，Larsen S，et al. Structure of the conserved domain of ANAC，a member of the NAC family of transcription factors[J]. EMBO Reports，2004，5（3）：297-303.

[7]Olsen A N，Ernst H A，Leggio L L，et al. NAC transcription factors：structurally distinct，functionally diverse[J]. Trends in Plant Science，2005，10（2）：79-87.

[8]Souer E，Vanhouwelingen A，Kloos D，et al. The no apical meristem gene of petunia is required for pattern formation in embryos and flowers and is expressed at meristem and primordia boundaries[J]. Cell，1996，85（2）：159-170.

[9]Aida M，Ishida T，Fukaki H，et al. Genes involved in organ separation in Arabidopsis：an analysis of the cup-shaped cotyledon mutant[J]. The Plant Cell，1997，9（6）：841-857.

[10]Zhu M，Chen G，Hu Z，et al. A new tomato NAC （NAM/ATAF1/2/CUC2） transcription factor，SlNAC4，functions as a positive regulator of fruit ripening and carotenoid accumulation[J]. Plant Cell Physiol，2014，55：119-135.

[11]Hu H H，Dai M Q，Yao J L，et al. Overexpressing a NAM，ATAF，and CUC （NAC） transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103（35）：12987-12992.

[12]Saad A S，Li X，Li H P，et al. A rice stress-responsive NAC gene enhances tolerance of transgenic wheat to drought and salt stresses[J]. Plant Science：an International Journal of Experimental Plant Biology，2013，203-204（204）：33-40.

[13]Moon Y H，Kang H G，Jung J Y，et al. Determination of the motif responsible for interaction between the rice APETALA1/AGAMOUS-LIKE9 family proteins using a yeast two-hybrid system[J]. Plant Physiology，1999，120（4）：1193-1203.

[14]Singh R，Lee M O，Lee J E，et al. Rice mitogen-activated protein kinase interactome analysis using the yeast two-hybrid system[J]. Plant Physiology，2012，160（1）：477-487.

[15]Petroni K，Kumimoto R W，Gnesutta N，et al. The promiscuous life of plant NUCLEAR FACTOR Y transcription factors[J]. The Plant Cell，2012，24（12）：4777-4792.