MicroRNA—218miR—218在腎透明細胞癌中的表達及臨床意義

任小強　張建國　辛士永　程濤

[摘要] 目的 研究miR-218在腎透明細胞癌中的表達及其與臨床病理之間的關系。方法 收集2012年3月—2013年5月間在該院就診的46例病理確診為腎透明細胞癌組織和30例癌旁≥3.0 cm正常腎組織作為對照組，采用Realtime PCR方法檢測microRNA-218在腎透明細胞癌組織和癌旁≥3.0 cm正常腎組織的表達，分析microRNA-218表達水平與腎透明細胞癌臨床病理參數之間的關系。結果 與對照組癌旁正常腎組織相比， miR-218在腎透明細胞癌組織的的表達明顯降低 （P<0.001）。同時， miR-218表達的降低與腫瘤的分期，轉移和分化程度有密切關系。miR-218的表達與患者的年齡， 性別， 腫瘤位置及腫瘤大小無明顯統計學意義。但是， miR-218的表達與腫瘤的轉移（P=0.007）， 腫瘤的 T分期 （P=0.022） 及腫瘤的分級 （P=0.015）有統計學意義。結論 miR-218在腎透明細胞癌中和腫瘤分期、分化、轉移有著很大的相關性。miR-218在腎透明細胞癌組織呈下調表達，其可能成為腎細胞癌新的潛在的治療靶點及診斷預后的分子標志物。

[關鍵詞] 腎透明細胞癌（RCCC）； miR-218； 侵襲； 轉移

[中圖分類號] R737.11 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2014）04（b）-0020-02

[Abstract] Objective To investigate the expression of miR-218 in renal clear cell carcinoma and its relationship with clinical pathology. Methods The renal clear cell carcinoma tissue of 46 cases of patients diagnosed with renal clear cell carcinoma in our hospital from March， 2012 to May， 2013 were selected and 30 cases of normal renal tissues ≥ 3.0cm adjacent to carcinoma as the control group. Realtime PCR method was used to detect the expression of microRNA-218 in renal clear cell carcinoma tissue and normal renal tissue ≥ 3.0cm adjacent to carcinoma. The relationship between the expression of microRNA-218 and renal clear cell carcinoma clinicopathological parameters was analyzed. Results Compared with the control tissues， miR-218 expression in the RCCC tissues was significantly lower （P<0.001）. Moreover， low miR-218 was closely associated with the stage， metastasis， and the grade of the tumor. The expression of miR-218 with the patient's age and gender， tumor location and tumor size had no statistical significance. But the expression of miR-218 with the tumor metastasis （P=0.007）， tumor T staging （P=0.022） and tumor grade （P=0.015）， had statistical significance. Conclusion MiR-218 was strongly correlated to RCCC stage， tumor grade， tumor metastasis. MiR-218 was low express in the tissues of RCCC，it may be used as a potential therapeutic target，a diagnostic biomarker and a prognostic predictor in patients with RCCC in future.

[Key words] Renal clear cell carcinoma （RCCC）； miR-218； Invasion； Metastasis 隨著目前分子生物學技術的突飛猛進以及對惡性腫瘤發生的細胞分子水平研究的深入，從基因水平尋找腎癌防治的新途徑成為研究的熱點。MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中發現的一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA，其大小長約20～25個核苷酸。最近的研究[1]表明miRNA參與各種各樣的調節途徑，包括發育、病毒防御、造血過程、器官形成、細胞增殖和凋亡等。miRNA在多種腫瘤中存在表達異常，可以發揮癌基因或抑癌基因作用，它已經顯示出能抑制某些重要腫瘤相關基因表達，在腫瘤發生、發展、預后中扮演十分重要的角色[2]。目前有關miR-218的研究報道不多，miR-218參與了很多腫瘤的發生、發展。該研究于2012年3月—2013年5月間通過檢測microRNA-218在腎透明細胞癌組織中的表達，分析其與臨床病理之間的關系，探討miR-218對腎透明細胞癌組織的影響，從而初步揭示miR-218在腎透明細胞癌中的生物學功能。報道如下。

1 資料與方法

1.1 標本收集

收集河南科技大學第一附屬醫院的46例腎細胞癌癌組織及30例癌旁≥3.0 cm正常腎組織作為對照組。所有組織標本均經病理學診斷確認為腎細胞癌。其中腎細胞癌中，低分化11例，中分化17例，高分化18例，根據TNM分期，臨床Ⅰ期21例， 臨床Ⅱ期13例，臨床Ⅲ期8例 臨床Ⅳ期4例 ，有淋巴結轉移的14例，無淋巴結轉移的32例，患者年齡28～80歲，平均年齡53.6歲 ，其中男性31例，女性15例。

1.2 RNA提取和 qRT-PCR

選用美國Invotrogen公司的RNA提取試劑盒，抽提組織總RNA。用紫外分光光度計于 260 和280 nm 波長處測定 RNA 提取液的吸光度（D）值，檢測 RNA 純度和濃度。用Invitrogen公司NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis 和 qRT-PCR Kits進行加PolyA尾巴和反轉錄。操作程序為將消化后RNA 10 μL 、5×反轉錄緩沖液 4 μL、25 mmol/LMnCl2 2 μL、2 mmol/L ATP 1 μL、Poly A Polymerase 0.4μL、用DEPC 處理后的無酶水補至 20 μL，放置37 ℃15 min， 再取加Poly A后RNA 8 μL、Annealing Buffer 1 μL、 Universal RT Primer（25uM）3 μL，65 ℃孵育5 min，迅速冰浴2～10 min，短暫離心，繼續向以上反應液中加入2xFirst Strand Buffer 10 μL、SuperScriptⅢ RT/RNaseOut Enzyme mix 2 μL輕輕吸打混勻，50 ℃孵育50 min。反應結束后 85 ℃保溫5 min。

使用羅氏公司的7 500型熒光定量PCR儀，采用2-△△CT法進行數據的相對定量分析。RealTime反應體系為：2x REALSYBRMixture 10 uL、10 umol/Lmir-218 上游引物0.4 μL、10 umol/Lmir-218 下游引物 0.4 μL、反轉錄產物 2 μL， 加入滅菌蒸餾水至20 μL。擴增程序為：95 ℃ 10 min，（95 ℃15sec，60 ℃60sec）×40個循環。以U6 基因表達作為內參。miR-218 的相對表達量通過公式2-△△CT計算，其中 ΔCt = miR-218Ct 值- U6Ct 值。

1.3 統計方法

采用SPSS17.0軟件進行統計學分析。miR-218在腎細胞癌癌組織與癌旁正常腎組織的表達差異采用獨立樣本的t檢驗。miR-218的表達與腎細胞癌臨床病理學特征的關聯采用非參數Mann Whitney U檢驗。

2 結果

與對照組癌旁正常腎組織相比， miR-218在腎透明細胞癌組織的的表達明顯降低，差異有統計學意義（P<0.001，圖A）。同時， miR-218表達的降低與腫瘤的分期，轉移和分化程度有密切關系（圖B， 圖C，圖D）。miR-218的表達與患者的年齡（P=0.817）， 性別（P=0.951）， 腫瘤位置（P=0.914）及腫瘤大?。≒=0.354）差異無統計學意義。但是， miR-218的表達與腫瘤的轉移，差異有統計學意義（P=0.007）， 腫瘤的 T分期，差異有統計學意義 （P=0.022）及腫瘤的分級，差異有統計學意義（P=0.015），見表1。

3 討論

腫瘤的侵襲和轉移仍是腫瘤高死亡率的主要原因。在最新的一些研究報告中，MiR -218可以抑制腫瘤的進展和侵襲，可以明顯降低人類惡性腫瘤發生[3]。然而，miR-218在腎癌中的作用尚未進一步的研究。

該研究發現，MiR-218在腎透明細胞癌組織中的表達是減少的，明顯低于對照組（P<0.001），尤其是在腫瘤晚期，表達明顯降低，顯示出它在腫瘤進展與侵襲中的作用更加突出。miR-218在腎癌中的這種現象符合之前的研究報道[4-6]。此外，在腫瘤組中， miR-218在晚期腎透明細胞癌組織中的表達水平明顯低于早期腎透明細胞癌（P<0.001）。低分化腎透明細胞癌中miR-218的表達水平明顯低于高/中分化腎透明細胞癌（P<0.05），有淋巴結轉移的腎透明細胞癌組織中miR-218顯示明顯低表達（P<0.001）。由于miR-218已經被證明在宮頸腺癌以及許多其他惡性腫瘤中與腫瘤的轉移及侵襲明顯相關[7-8]，而該研究進一步顯示miR-218在腎惡性腫瘤的轉移及侵襲中也可能是一個重要的因素[9]。

綜上，研究發現，miR-218在腎細胞癌組織中與分期、分化、轉移是有密切關系的，其表達水平與臨床進展呈負相關，miR-218在腎細胞癌中作為一個腫瘤抑制基因，揭示了其可能成為腎癌新的潛在的治療靶點。

[參考文獻]

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（收稿日期：2014-01-05）

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（收稿日期：2014-01-05）