熒光PCR技術(shù)批量快速篩查腸道致病菌混合樣本的研究

吳桂芬等

[摘要] 目的 尋找從業(yè)人員腸道傳染病菌的快速篩查技術(shù)方法。方法 以參加健康體檢的從業(yè)人員作為研究對象，采集健康體檢從業(yè)人員的肛拭子標本，采用熒光PCR技術(shù)批量快速篩查腸道致病菌混合樣本的方法進行沙門氏菌和志賀氏菌檢測，并與國家標準方法進行對照，比較兩種檢測方法的檢出率結(jié)果。 結(jié)果 58 176份樣本中，共檢出52份沙門菌陽性標本，陽性率為0.89‰，檢出51份志賀氏菌陽性標本，陽性率為0.88‰。合計共檢出致病菌103份，檢出率為1.77‰。熒光PCR對沙門菌和志賀氏菌的靈敏度達到了100%，特異性也保持在99%以上。結(jié)論 采用熒光PCR技術(shù)進行腸道致病菌的快速篩查能縮短檢驗時間，檢驗準確性高，從而有效阻斷腸道傳染病的傳播和食物中毒的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞] 熒光PCR；腸道致病菌；快速篩查

[中圖分類號] R446.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2014）07（c）-0181-02

[Abstract] Objective To find out a detection method for rapidly detecting the enteric pathogens in practitioners in food industry and public places. Methods The practitioners underwent healthy examination were selected as the subjects. And the anal swab specimens of them were collected. Fluorescent PCR method for rapidly detecting batch enteric pathogens mixed samples was used to detect the Salmonella and Shigella， and was compared with the national standard method. The detection rate of these two detection methods was compared. Results Of the 58176 samples， 52 samples with positive Salmonella were detected， the positive rate was 0.89‰， 51 samples with positive Shigella were detected， the positive rate was 0.88‰. A total 103 pathogenic bacteria were detected， the detection rate was 1.77‰. The sensitivity and specificity of the fluorescent PCR detection method for Salmonella and Shigella was 100% and 99%， respectively. Conclusion Fluorescent PCR method for rapidly detecting the enteric bacteria can shorten the detection time but with a high diagnostic accuracy， thereby effectively blocking the spread of intestinal infectious diseases and the incidence of food poisoning.

[Key words] Fluorescent PCR； Enteric pathogens； Rapid screening

我國法律規(guī)定，從事食品和公共場所的從業(yè)人員不能攜帶有傷寒、副傷寒和痢疾病原菌等[1]。為進一步探討腸道致病菌的篩查檢驗方法，以縮短檢驗步驟，提高檢驗結(jié)果準確性，該研究選取2013年6—12月到該中心進行健康體檢的從業(yè)人員肛拭子樣本58 176份，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該中心進行健康體檢的從業(yè)人員肛拭子樣本58 176份，其中男性29 473人，女28 703人。采用熒光PCR技術(shù)批量快速篩查腸道致病菌混合樣本的方法進行沙門氏菌和志賀氏菌檢測。

1.2 檢測方法

①采集方法。采用特定的環(huán)孔狀肛拭采樣器進行肛拭子樣本采樣。在進行采樣時，將棉簽插入肛齒線內(nèi)3 cm左右，旋轉(zhuǎn)3周后取出樣本，然后將樣本放入采樣管中進行保管。各種細菌的增菌及分離所用試劑和培養(yǎng)基均為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品，細菌生化鑒定條法國生物梅里埃產(chǎn)品， 實時熒光PCR 檢測試劑盒為深圳生科源技術(shù)有限公司產(chǎn)品，血清診斷試劑為寧波華潤生物制品研究所產(chǎn)品。

②熒光PCR檢測。首先將采集到的樣本放入37 ℃的恒溫箱中進行培養(yǎng)，時間在3～6 h。然后將每份培養(yǎng)后的標本取80 μL，每10份標本混合為1組[2]，然后進行混合，再加入20 μLDNA提取液進行充分混合，標本混合后做好編號、記錄。然后抽取5 μL的混合標本加入8聯(lián)PCR反應(yīng)管內(nèi)。并對所抽取的標本進行5 min的離心。此時8聯(lián)PCR反應(yīng)管有8份混合標本，實際代表了80份的標本[3]。然后將反應(yīng)管中的標本置于熒光PCR儀上進行檢測。

③對所有樣本同時以傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法作為“金標準”進行檢驗[4]。

1.3 觀察指標

①熒光PCR技術(shù)檢測結(jié)果判斷；②對比熒光PCR技術(shù)檢驗和“金標準”的檢測速度、靈敏度和特異性。endprint

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，用（x±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 熒光PCR技術(shù)中陽性檢測情況

58 176份從業(yè)人員肛拭子樣本的檢測結(jié)果中，共檢出52份沙門菌陽性標本，陽性率為0.89‰，檢出51份志賀氏菌陽性標本，陽性率為0.88‰。合計共檢出致病菌103份，檢出率為1.77‰。見見表1。

3 討論

隨著科技的進步，醫(yī)療診斷技術(shù)的完善，檢測技術(shù)的快速化、自動化、準確化已經(jīng)成為各類檢測方法的發(fā)展趨勢[5]，而對于從業(yè)人員腸道致病菌的檢查更是關(guān)系到食品衛(wèi)生安全，更應(yīng)該受到更多的關(guān)注。

熒光PCR技術(shù)用于從業(yè)人員體檢腸道致病菌快速檢測，其具有高靈敏性和高準確性，能夠提高致病菌的陽性檢出率[6]，從而有利于防止疾病的傳播。

利用熒光PCR技術(shù)進行腸道致病菌的檢測簡單、快速，可以在4～5 h內(nèi)完成肛拭子樣本的初步篩查，并且可以排除隱形標本，可以在第2個工作日完成，第3個工作日就可以領(lǐng)取相應(yīng)健康證明[7]，而以傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法的“金標準”則在第4個工作日時才能完成檢驗[8]，且操作程序復雜，主觀影響因素較大，極易產(chǎn)生檢測誤差，影響檢測結(jié)果[9]。采用熒光PCR技術(shù)進行檢查，可以有效縮短檢驗時間。另外，熒光PCR技術(shù)可以顯著減少后期細菌的培養(yǎng)以及鑒定工作程序，提高陽性檢出率[10]，在整個操作環(huán)境中盡量避免了對試驗器具的重復利用，從而降低了標本被污染的風險，使得檢驗結(jié)果更加客觀、準確。我國食品從業(yè)人員較多，如果普遍采用熒光PCR技術(shù)進行檢查，可以有效縮短檢查時間[11]，及時發(fā)現(xiàn)疾病的傳染源，從而控制傳染源、切斷傳播途徑[12]，防止傳染病的傳播流行，同時，也可防止傳染病菌攜帶者污染食物，防止食物中毒的發(fā)生，具有極大的社會效益。

該研究中共檢出52份沙門菌陽性標本，陽性率為0.89‰，檢出51份志賀氏菌陽性標本，陽性率為0.88‰。合計共檢出致病菌103份，檢出率為1.77‰。在靈敏度與特異性比較方面，熒光PCR對沙門菌和志賀氏菌的靈敏度達到了100%，特異性也保持在99%以上，說明利用熒光PCR技術(shù)進行腸道致病菌的檢驗能有效節(jié)省檢測時間，檢驗準確性高，值得臨床推廣應(yīng)用。與傳統(tǒng)方法相比，熒光PCR存在著獨特的優(yōu)勢和特點， PCR技術(shù)與其它分子生物學技術(shù)相結(jié)合使定量極微量的基因表達或DNA拷貝數(shù)成為可能[13]，最近研究報道[14]，其最低可檢測含10個霍亂弧菌的樣本，國內(nèi)多數(shù)檢測試劑盒可檢測102拷貝的病原體核酸。但同時也應(yīng)意識到PCR檢測技術(shù)中存在的局限性[15]，在試驗操作過程中規(guī)范操作方法和操作路徑，嚴格樣本采集程序，從而使得樣本檢測結(jié)果更加準確、科學。

研究認為如能恰當采用熒光法應(yīng)用于腸道致病菌檢測，將產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。由于實時熒光方法操作簡便，有規(guī)范的作業(yè)指導，具有推廣應(yīng)用價值。

[參考文獻]

[1] 馬淑貞，周卓晟，石曉路. 應(yīng)用實時熒光PCR法快速檢測從業(yè)體檢人群腸道致病菌結(jié)果分析[J].熱帶醫(yī)學雜志，2013，13（11）：1412-1414.

[2] 汪武新，韋炳揚，劉海文，等.熒光PCR快速檢測從業(yè)人員腸道致病菌結(jié)果分析[J].中國熱帶醫(yī)學，2011，11（8）：971-972.

[3] 曾斤日，劉愛民，彭守柏. 實時PCR篩查、培養(yǎng)法確認方案在從業(yè)人員腸道致病菌檢測的研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010，20（7）：1711-1713.

[4] 王琳，江鵬飛，李貽漢，等. 熒光PCR在基層從業(yè)人員帶菌檢測中應(yīng)用的可行性評價[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2013，12（3）：664-666.

[5] 吳海娟. 實時熒光PCR快速同時檢測從業(yè)人員沙門菌和志賀菌結(jié)果分析[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學，2013，22（12）：2323-2325.

[6] 邱亞群，扈慶華，汪武新，等. 熒光PCR對從業(yè)人員腸道致病菌篩查的評價[J].中國熱帶醫(yī)學，2009，9（1）：12-13.

[7] 侯宇.熒光定量PCR技術(shù)研究進展及其應(yīng)用[J].貴州農(nóng)業(yè)科學，2009，13（6）：29-32，35.

[8] 陳賢革.熒光PCR技術(shù)應(yīng)用的研究進展[J].畜牧與飼料科學，2010，11（2）：162-164.

[9] 陳旭，齊鳳坤，康立功，等. 實時熒光定量PCR技術(shù)研究進展及其應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報，2010，9（8）：148-155.

[10] 施林祥，李東輝. 實時熒光PCR研究新進展[J].世界華人消化雜志，2009，12（5）：596-599.

[11] 高斌，劉敬忠. 實時熒光PCR技術(shù)的研究及其應(yīng)用進展[J].診斷學理論與實踐，2010，10（6）：507-509.

[12] 徐勝玲，蔡師志，湯國球.服務(wù)行業(yè)從業(yè)人員腸道沙門氏菌檢測結(jié)果分析[J].熱帶醫(yī)學雜志，2010，6（9）：108-109.

[13] 曹瑋，王明忠，王曉英，等. 核酸檢測及相關(guān)技術(shù)在食源性致病菌快速檢測中的研究[J]. 衛(wèi)生研究， 2008， 37（2）： 245-248.

[14] Gubala AJ， Proll DF. Molecular-beacon multiplex real-time PCR assay for detection of Vibrio cholerae[J]. Applied and environmental microbiology， 2006， 72（9）： 6424-6428.

[15] 朱文斯，黃茜華，黃艷蘭，等. 含內(nèi)標的熒光PCR—熒光定量PCR[J]. 中國醫(yī)藥導刊，2011，12（4）：309-310，302.

（收稿日期：2014-04-28）endprint

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，用（x±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 熒光PCR技術(shù)中陽性檢測情況

58 176份從業(yè)人員肛拭子樣本的檢測結(jié)果中，共檢出52份沙門菌陽性標本，陽性率為0.89‰，檢出51份志賀氏菌陽性標本，陽性率為0.88‰。合計共檢出致病菌103份，檢出率為1.77‰。見見表1。

3 討論

隨著科技的進步，醫(yī)療診斷技術(shù)的完善，檢測技術(shù)的快速化、自動化、準確化已經(jīng)成為各類檢測方法的發(fā)展趨勢[5]，而對于從業(yè)人員腸道致病菌的檢查更是關(guān)系到食品衛(wèi)生安全，更應(yīng)該受到更多的關(guān)注。

熒光PCR技術(shù)用于從業(yè)人員體檢腸道致病菌快速檢測，其具有高靈敏性和高準確性，能夠提高致病菌的陽性檢出率[6]，從而有利于防止疾病的傳播。

利用熒光PCR技術(shù)進行腸道致病菌的檢測簡單、快速，可以在4～5 h內(nèi)完成肛拭子樣本的初步篩查，并且可以排除隱形標本，可以在第2個工作日完成，第3個工作日就可以領(lǐng)取相應(yīng)健康證明[7]，而以傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法的“金標準”則在第4個工作日時才能完成檢驗[8]，且操作程序復雜，主觀影響因素較大，極易產(chǎn)生檢測誤差，影響檢測結(jié)果[9]。采用熒光PCR技術(shù)進行檢查，可以有效縮短檢驗時間。另外，熒光PCR技術(shù)可以顯著減少后期細菌的培養(yǎng)以及鑒定工作程序，提高陽性檢出率[10]，在整個操作環(huán)境中盡量避免了對試驗器具的重復利用，從而降低了標本被污染的風險，使得檢驗結(jié)果更加客觀、準確。我國食品從業(yè)人員較多，如果普遍采用熒光PCR技術(shù)進行檢查，可以有效縮短檢查時間[11]，及時發(fā)現(xiàn)疾病的傳染源，從而控制傳染源、切斷傳播途徑[12]，防止傳染病的傳播流行，同時，也可防止傳染病菌攜帶者污染食物，防止食物中毒的發(fā)生，具有極大的社會效益。

該研究中共檢出52份沙門菌陽性標本，陽性率為0.89‰，檢出51份志賀氏菌陽性標本，陽性率為0.88‰。合計共檢出致病菌103份，檢出率為1.77‰。在靈敏度與特異性比較方面，熒光PCR對沙門菌和志賀氏菌的靈敏度達到了100%，特異性也保持在99%以上，說明利用熒光PCR技術(shù)進行腸道致病菌的檢驗能有效節(jié)省檢測時間，檢驗準確性高，值得臨床推廣應(yīng)用。與傳統(tǒng)方法相比，熒光PCR存在著獨特的優(yōu)勢和特點， PCR技術(shù)與其它分子生物學技術(shù)相結(jié)合使定量極微量的基因表達或DNA拷貝數(shù)成為可能[13]，最近研究報道[14]，其最低可檢測含10個霍亂弧菌的樣本，國內(nèi)多數(shù)檢測試劑盒可檢測102拷貝的病原體核酸。但同時也應(yīng)意識到PCR檢測技術(shù)中存在的局限性[15]，在試驗操作過程中規(guī)范操作方法和操作路徑，嚴格樣本采集程序，從而使得樣本檢測結(jié)果更加準確、科學。

研究認為如能恰當采用熒光法應(yīng)用于腸道致病菌檢測，將產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。由于實時熒光方法操作簡便，有規(guī)范的作業(yè)指導，具有推廣應(yīng)用價值。

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[3] 曾斤日，劉愛民，彭守柏. 實時PCR篩查、培養(yǎng)法確認方案在從業(yè)人員腸道致病菌檢測的研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010，20（7）：1711-1713.

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[6] 邱亞群，扈慶華，汪武新，等. 熒光PCR對從業(yè)人員腸道致病菌篩查的評價[J].中國熱帶醫(yī)學，2009，9（1）：12-13.

[7] 侯宇.熒光定量PCR技術(shù)研究進展及其應(yīng)用[J].貴州農(nóng)業(yè)科學，2009，13（6）：29-32，35.

[8] 陳賢革.熒光PCR技術(shù)應(yīng)用的研究進展[J].畜牧與飼料科學，2010，11（2）：162-164.

[9] 陳旭，齊鳳坤，康立功，等. 實時熒光定量PCR技術(shù)研究進展及其應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報，2010，9（8）：148-155.

[10] 施林祥，李東輝. 實時熒光PCR研究新進展[J].世界華人消化雜志，2009，12（5）：596-599.

[11] 高斌，劉敬忠. 實時熒光PCR技術(shù)的研究及其應(yīng)用進展[J].診斷學理論與實踐，2010，10（6）：507-509.

[12] 徐勝玲，蔡師志，湯國球.服務(wù)行業(yè)從業(yè)人員腸道沙門氏菌檢測結(jié)果分析[J].熱帶醫(yī)學雜志，2010，6（9）：108-109.

[13] 曹瑋，王明忠，王曉英，等. 核酸檢測及相關(guān)技術(shù)在食源性致病菌快速檢測中的研究[J]. 衛(wèi)生研究， 2008， 37（2）： 245-248.

[14] Gubala AJ， Proll DF. Molecular-beacon multiplex real-time PCR assay for detection of Vibrio cholerae[J]. Applied and environmental microbiology， 2006， 72（9）： 6424-6428.

[15] 朱文斯，黃茜華，黃艷蘭，等. 含內(nèi)標的熒光PCR—熒光定量PCR[J]. 中國醫(yī)藥導刊，2011，12（4）：309-310，302.

（收稿日期：2014-04-28）endprint

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，用（x±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 熒光PCR技術(shù)中陽性檢測情況

58 176份從業(yè)人員肛拭子樣本的檢測結(jié)果中，共檢出52份沙門菌陽性標本，陽性率為0.89‰，檢出51份志賀氏菌陽性標本，陽性率為0.88‰。合計共檢出致病菌103份，檢出率為1.77‰。見見表1。

3 討論

隨著科技的進步，醫(yī)療診斷技術(shù)的完善，檢測技術(shù)的快速化、自動化、準確化已經(jīng)成為各類檢測方法的發(fā)展趨勢[5]，而對于從業(yè)人員腸道致病菌的檢查更是關(guān)系到食品衛(wèi)生安全，更應(yīng)該受到更多的關(guān)注。

熒光PCR技術(shù)用于從業(yè)人員體檢腸道致病菌快速檢測，其具有高靈敏性和高準確性，能夠提高致病菌的陽性檢出率[6]，從而有利于防止疾病的傳播。

利用熒光PCR技術(shù)進行腸道致病菌的檢測簡單、快速，可以在4～5 h內(nèi)完成肛拭子樣本的初步篩查，并且可以排除隱形標本，可以在第2個工作日完成，第3個工作日就可以領(lǐng)取相應(yīng)健康證明[7]，而以傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法的“金標準”則在第4個工作日時才能完成檢驗[8]，且操作程序復雜，主觀影響因素較大，極易產(chǎn)生檢測誤差，影響檢測結(jié)果[9]。采用熒光PCR技術(shù)進行檢查，可以有效縮短檢驗時間。另外，熒光PCR技術(shù)可以顯著減少后期細菌的培養(yǎng)以及鑒定工作程序，提高陽性檢出率[10]，在整個操作環(huán)境中盡量避免了對試驗器具的重復利用，從而降低了標本被污染的風險，使得檢驗結(jié)果更加客觀、準確。我國食品從業(yè)人員較多，如果普遍采用熒光PCR技術(shù)進行檢查，可以有效縮短檢查時間[11]，及時發(fā)現(xiàn)疾病的傳染源，從而控制傳染源、切斷傳播途徑[12]，防止傳染病的傳播流行，同時，也可防止傳染病菌攜帶者污染食物，防止食物中毒的發(fā)生，具有極大的社會效益。

該研究中共檢出52份沙門菌陽性標本，陽性率為0.89‰，檢出51份志賀氏菌陽性標本，陽性率為0.88‰。合計共檢出致病菌103份，檢出率為1.77‰。在靈敏度與特異性比較方面，熒光PCR對沙門菌和志賀氏菌的靈敏度達到了100%，特異性也保持在99%以上，說明利用熒光PCR技術(shù)進行腸道致病菌的檢驗能有效節(jié)省檢測時間，檢驗準確性高，值得臨床推廣應(yīng)用。與傳統(tǒng)方法相比，熒光PCR存在著獨特的優(yōu)勢和特點， PCR技術(shù)與其它分子生物學技術(shù)相結(jié)合使定量極微量的基因表達或DNA拷貝數(shù)成為可能[13]，最近研究報道[14]，其最低可檢測含10個霍亂弧菌的樣本，國內(nèi)多數(shù)檢測試劑盒可檢測102拷貝的病原體核酸。但同時也應(yīng)意識到PCR檢測技術(shù)中存在的局限性[15]，在試驗操作過程中規(guī)范操作方法和操作路徑，嚴格樣本采集程序，從而使得樣本檢測結(jié)果更加準確、科學。

研究認為如能恰當采用熒光法應(yīng)用于腸道致病菌檢測，將產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。由于實時熒光方法操作簡便，有規(guī)范的作業(yè)指導，具有推廣應(yīng)用價值。

[參考文獻]

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[4] 王琳，江鵬飛，李貽漢，等. 熒光PCR在基層從業(yè)人員帶菌檢測中應(yīng)用的可行性評價[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2013，12（3）：664-666.

[5] 吳海娟. 實時熒光PCR快速同時檢測從業(yè)人員沙門菌和志賀菌結(jié)果分析[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學，2013，22（12）：2323-2325.

[6] 邱亞群，扈慶華，汪武新，等. 熒光PCR對從業(yè)人員腸道致病菌篩查的評價[J].中國熱帶醫(yī)學，2009，9（1）：12-13.

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（收稿日期：2014-04-28）endprint