新型FKBPs配體HD5-6對SAMP8小鼠的抗老化研究

張延明， 肖軍海， 趙 云， 韓 丹， 王大江， 楊 靜， 方伯言

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種漸進性、致死性神經退行性疾病，其發病機制尚不完全清楚，因此對AD發病機制的探索和對其防治藥物的研究開發成為醫學研究熱點之一。近些年臨床主要應用神經營養因子類藥物治療神經退行性疾病，但多因為透過血腦屏障的能力較差，臨床使用限制較多，因此人們逐漸把研究方向轉向小分子類化合物。20世紀90年代初，人們在研究小分子免疫抑制劑FK506的實驗中意外發現其可以加快神經的再生速率，并陸續在動物體內和體外細胞實驗中證實其具有促神經再生的作用［1］，同時人們發現與FK506結合的 FK506 結合蛋白［2］(FK506 binding proteins，FKBPs)在腦組織中的濃度遠大于其在免疫組織中的濃度，并在神經受損和疾病狀態下表達上調［3，4］。因此以 FK506和 FKBPs為基礎研究治療神經退行性疾病的小分子神經保護類藥物成為一個熱門方向。

噻嗪酰胺衍生物(HD5-6)是由軍事醫學科學院毒物藥物研究所根據FKBPs以及其特異性配體FK506復合晶體結構研發的一種新結構小分子FKBPs配體。藥物研發的動物實驗證明其具有明顯的抗腦缺血的作用，在帕金森動物實驗中也具有較好的神經保護作用。本實驗通過檢測HD5-6干預后快速老化小鼠P系(senescence accelerated-prone mouse，SAMP)中的SAMP8亞系的行為學和病理學改變以及對其海馬神經元基因表達譜的影響，探討HD5-6對SAMP8小鼠的抗老化作用，為藥物的進一步研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 10月齡 SAMP8雄性小鼠20只，體重26～30 g，10月齡SAMR1雄性小鼠10只，體重30～35 g，由天津中醫藥大學第一附屬醫院老年動物中心提供(動物合格證號:SCXK(津)-2008-0001)。飼養于軍事醫學科學院SPF級動物房。

1.1.2 藥品和試劑 HD5-6由中國人民解放軍軍事醫學科學院毒物藥物研究所提供，專利公開號CN 102675244A;TUNEL試劑盒購自美國progema公司，貨號G3250;mirVanaTM RNA Isolation Kit購自美國 Biosystem公司，p/n AM1556;RNeasy?Mini Kit購自德國QIAGEN公司，Design ID:028005。

1.1.3 主要儀器 Morris水迷宮系統，北京鼎大軟件技術有限公司;奧林巴斯BX61倒置熒光顯微鏡，日本。基因芯片檢測使用Agilent SurePrint G3 Mouse Gene Expression Microarray(8*60K)，委托上海歐易生物醫學醫學科技有限公司進行。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥 小鼠適應性飼養1 w后，將SAMP8隨機分為癡呆組(n=10)、HD5-6組(n=10);SAMR1(n=10)作為正常對照組。HD5-6組按10mg/kg體重腹腔注射HD5-6(用8%DMSO助溶配成溶液)溶液，癡呆組及正常對照組腹腔注射相應體積8%DMSO生理鹽水溶液，所有小鼠每天上午給藥1次，給藥總時間為35 d。

1.2.2 Morris水迷宮實驗 給藥4 w后，于29 d開始將3組小鼠進行5 d定位航行實驗。定位航行實驗結束24 h后，拆除平臺，選擇NW象限作為入水象限，記錄小鼠在60 s內穿過原平臺位置的次數，對小鼠在原平臺象限的游泳時間進行統計分析。

1.2.3 HE染色與TUNEL熒光染色 給藥結束后，每組隨機挑選7只小鼠用4%水合氯醛麻醉，快速開胸，經左心室插管，80 ml冰冷生理鹽水沖洗及100 ml 4%多聚甲醛PBS液灌注固定，取出完整大腦組織，透明、浸蠟、石蠟包埋，每只鼠連續5μm切片。每只鼠選取相同海馬層次切片常規脫蠟后，進行HE染色，并在高倍鏡下觀察其海馬結構。每只鼠選取相同海馬層次切片常規脫蠟后，按照TUNEL試劑盒說明書進行染色。在熒光顯微鏡下，每張陽性切片選取20個高倍熒光視野，計數凋亡細胞并計算凋亡百分率，即凋亡指數(apoptotic index，AI)，計算公式如下:AI=(陽性細胞數/總細胞數)×100%。

1.2.4 基因芯片檢測與分析 每組隨機選取3只小鼠，斷頭處死后，迅速在冰盒表面分離左側海馬，提取純化總 RNA，使用 Agilent SurePrint G3 Mouse Gene Expression Microarray(8*60K)芯片進行檢測。經反轉錄并標記的cRNA和芯片雜交，洗脫后利用Agilent Scanner G2505C掃描，分辨率為5 μmol/L。對于表達上調或者下調倍數變化值＞2.0且P值＜0.05的mRNA進行歸類分析。

1.3 統計學方法

實驗數據均以χ±s表示，并用 SPSS20.0軟件對各組數據進行正態檢驗及方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差不齊采用Dunnett檢驗。檢驗水準定為P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Morris水迷宮實驗

2.1.1 定位航行實驗 實驗中測得3組小鼠5 d的平均潛伏期見表1、表2、圖1。

表1 3組小鼠5 d的平均潛伏期(χ ± s，n=10)

表2 3組小鼠5 d潛伏期均值總體比較(χ±s)

圖1 各組平均逃避潛伏期5 d前后的變化

表1和圖1提示，在5 d的訓練實驗中，隨著小鼠訓練次數的增加，3組小鼠的潛伏期均表現為逐漸縮短的趨勢。癡呆組5 d的潛伏期始終明顯長于正常對照組(P ＜0.05)。HD5-6組3、4、5 d的潛伏期較癡呆組明顯縮短，差異有統計學意義(P＜0.05);HD5-6組3、4 d的潛伏期較正常對照組差異明顯(P＜0.05)，但5 d的潛伏期較正常對照組無統計學差異(P ＞0.05)。

表2提示，在定位航行實驗中，從3組小鼠5 d訓練的總體情況比較，癡呆組較正常對照組潛伏期明顯延長(P＜0.01)，HD5-6組潛伏期較癡呆組明顯縮短(P＜0.01)，但與正常對照組比較，潛伏期仍較長，具有顯著的統計學差異(P＜0.01)。

2.1.2 空間探索實驗 實驗6 d，拆除平臺，觀察小鼠的空間探索能力(見表3)，與正常對照組比較，癡呆組跨平臺次數與原平臺象限時間比都有統計學差異(P＜0.05);HD5-6組與癡呆組相比，跨平臺次數與原平臺象限時間比均有統計學差異(P＜0.05)，但與正常對照組相比，無統計學差異(P＞0.05)。

2.2 免疫組織化學

2.2.1 HE染色 由圖2可發現，正常對照組小鼠海馬區的神經元數量較多，排列整齊，界限清楚，細胞體積較大，較豐滿，細胞核較清晰;癡呆組海馬區神經元數量明顯減少，細胞排列紊亂，界限不清，大量的神經元細胞核固縮，深染、壞死，與正常對照組比較有顯著差異;與癡呆組小鼠相比，HD5-6組海馬區神經元數量相對較多，排列也相對規則，細胞間界限相對比較清晰，神經元細胞核壞死和固縮現象也相對減少，差異十分顯著，但與正常對照組相比，差異并不顯著。

圖2 小鼠海馬區神經元HE染色(×100，箭頭標注區為神經元)

2.2.2 TUNEL熒光染色 正常對照組小鼠海馬區神經元 AI為(28.02 ±11.25)%;癡呆組小鼠海馬區神經元AI為(51.73±4.48)%，與正常對照組相比，差異具有統計學意義(P＜0.05);HD5-6組小鼠海馬區神經元AI為(20.47±2.25)%，與癡呆組相比，具有顯著的統計學差異(P＜0.01)，但與正常對照組相比，無統計學差異(見圖3、表4)。

圖3 小鼠海馬區TUNEL熒光染色(×100，箭頭標注為凋亡神經元)

2.3 HD5-6對SAMP8海馬神經元基因表達譜的影響

與癡呆組基因表達譜相比，HD5-6干預的SAMP8小鼠海馬神經元的表達差異在2倍以上的基因有118條，表達上調的為9條，表達下調的為109條。其中有功能的mRNA中，表達上調的有4條，表達下調的有 21條，見表 5及表 6。其中 Nxph2、Herc6、S100a8、Pde7b、Tnni1、Wnt8b 等涉及了神經營養、信號傳導以及細胞凋亡途徑的mRNA均發生了差異表達，但差異基因表達的可靠性尚需進一步的驗證。

表3 3組小鼠空間探索實驗原平臺象限時間比與跨平臺次數比較(χ±s)

表4 3組小鼠海馬神經元凋亡指數(χ±s)

表5 HD5-6組中上調的差異表達基因

表6 HD5-6組中下調的差異表達基因

3 討論

目前AD的發病機制尚不十分清楚，其防治藥物的治療效果由于血腦屏障的存在而受到諸多的限制，由于發現小分子FKBPs配體FK506有神經保護和促神經生長作用，使FKBPs成為神經退行性疾病藥物研究的重要靶標。本課題使用的HD5-6就是根據FKBPs以及其特異性配體FK506復合晶體結構研發的一種新結構小分子FKBPs配體。但到目前為止，FKBPs配體神經保護和促神經生長作用的機制尚不十分清楚。

快速老化小鼠(senescence accelerated mouse，SAM)是日本京都大學竹田俊男教授在美國AKR/J系小白鼠基礎上長期培育得到的一種近交系衰老模型鼠，包括 SAMP(senescence accelerated-prone mouse)和SAMR(senescence accelerated-resistant mouse)兩種品系［5］。其中SAMP8在渡過4～6月齡后生長期后迅速出現學習記憶缺陷以及平均壽命較短和淀粉樣變性增加的快速衰老特征，其典型的癡呆癥狀和腦部病理變化，是目前研究AD較好的自然衰老動物模型。因此本課題選用SAMP8來研究HD5-6抗老化作用。

Morris水迷宮實驗是由英國心理學家Morris研究并設計，主要用于研究動物空間探索和辨別的學習記憶能力，以動物找到暗臺的潛伏期作為評定學習記憶能力的指標［6］。本實驗結果顯示，10月齡SAMP8雄鼠的學習記憶能力明顯低于同月齡SAMR1雄鼠，表現為:5 d的逃避潛伏期顯著延長，跨平臺次數、原平臺象限時間減少，分析判斷能力明顯低于正常對照組。給予HD5-6治療后的SAMP8逃避潛伏期明顯縮短，而探索實驗的結果顯示SAMR1和HD5-6治療后SAMP8的記憶保持能力比癡呆組強，提示 HD5-6可以改善快速老化小鼠SAMP8的學習記憶能力，但FKBPs配體改善小鼠學習記憶能力具體機制尚不十分清楚。FK506是一種大環內酯類強效免疫抑制劑［7］，它進入細胞后與FKBP結合，可以阻斷鈣調神經磷酸酶(Calcineurin，CaN)的活性［8］。CaN具有激活突觸前膜長時程減弱(LTD)和抑制突觸后膜長時程增強(LTP)的作用［9］，可以有效的抑制海馬神經元突觸后活動，因此與海馬依賴的記憶形成密切相關的海馬神經元突觸活動在CaN高表達時會被過度抑制，進而消弱了海馬依賴的記憶形成。因此人們推斷應用FKBPs配體時可能通過抑制CaN的過度表達改善海馬依賴的記憶功能。

研究證實，FKBPs配體是目前已知的唯一的具有神經保護和促神經生長作用的有機小分子物質，具有促進PC12細胞和背根神經突起的生長，并且可以促進體內周圍神經損傷后的功能修復和神經再生［10，11］。本實驗HE染色顯示與正常對照組相比，癡呆組海馬神經元數量明顯減少，細胞排列紊亂，并且可以發現大量的神經元細胞核固縮、深染、壞死;給予HD5-6干預的SAMP8小鼠海馬區神經元數量顯著增多，細胞核固縮壞死現象明顯減少，提示HD5-6能夠延緩甚至改善SAMP8小鼠海馬神經元的病理改變。TUNEL結果顯示，SAMR1與給予HD5-6治療的SAMP8海馬神經元凋亡指數明顯低于癡呆組，提示HD5-6能夠延緩SAMR8海馬神經元凋亡速度。在經典的N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)介導的神經細胞死亡通路中，谷氨酸與NMDA受體結合后，引起Ca2+大量流入神經細胞內，并與肌鈣蛋白結合，激活有活性的一氧化氮合成酶(nitricoxide synthase，NOS)，促進NO的產生，損傷神經元，而非活性的NOS需要在CaN作用下脫磷酸化從而具備活性，因此人們推斷FKBPs配體可能通過抑制NOS活性，減少NO損傷神經元［12］。本實驗芯片結果顯示，編碼肌鈣蛋白的Tnni1表達下調，從而降低了谷氨酸進入NMDA通路的能力，減少了NO的產生，這也提示了HD5-6可能通過上述機制起到保護神經元的作用。

FKBPs配體發揮神經保護作用的機制并不是唯一的。CaN是一種Ca2+鈣調蛋白依賴的蛋白磷酸激酶，對T細胞的活化Ca2+介導的信號傳導過程起限制酶作用，在促坐骨神經再生的實驗中，FK506可以減少淋巴細胞在神經損傷早期的局部浸潤，研究者推斷其可能通過抑制CaN活性，從而抑制T細胞活化中IL-2基因的轉錄，阻斷Ca2+依賴性T細胞的活化途徑，抑制T淋巴細胞在損傷部位聚集、活化，減輕T淋巴細胞對損傷變性軸突的破壞［13，14］，達到對損傷神經的保護作用。基因芯片結果顯示，與癡呆組相比，HD5-6組海馬神經元的表達差異在2倍以上的基因有118條，其中有功能的mRNA中，表達上調的有4條，表達下調的有21條。其中 Lcn2、S100a8、Oc90、Cabp5、Cacna1s等與 Ca2+轉運有關的蛋白分別發生了不同程度的上調或者下調，提示HD5-6可能通過影響與鈣離子有關的蛋白起到對CaN抑制作用，從而達到神經保護作用。另外研究發現，生長相關蛋白-43(GAP-43)作為神經元生長錐中的主要磷酸蛋白，同時也是Calcineurin的底物，FK506可以通過抑制Calcineurin活性，增加GAP-43活性［15，16］，促進神經生長。同時本實驗結果顯示參與神經肽信號轉導途徑的Nxph2的表達上調也提示了FKBPs配體HD5-6可能存在其它的發揮神經保護作用的途徑。綜上所述，FKBPs配體HD5-6能夠改善快速老化小鼠SAMP8的學習記憶能力和海馬神經元病理改變，并且通過對基因表達譜產生的影響發揮明顯的抗衰老作用，為下一步的藥物研究提供了重要的理論依據。但HD5-6延緩SAMP8小鼠的衰老具體機制還需進一步的研究證實。

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