卷柏乙醇提取物對14種植物病原菌的抑制活性

劉霞+龔永歡+王艷紅+肖巧玉+袁小紅+馬林

摘要：采用牛津杯法及瓊脂打孔法測定卷柏（Selaginella tamariscina）乙醇提取物對4種植物病原細菌[柑橘潰瘍病菌（Xanthomonas carotovora pv.citri）、姜瘟病菌（Ralstonia solanacearum）、水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）、大白菜軟腐病菌（Erwinia carotovora pv. carotovora）]的抗菌活性。結果表明，在濃度為1 mg/mL時，卷柏乙醇提取物對4種供試細菌具有較好的抑制活性，抑菌圈直徑13.6～15.3 mm，對姜瘟病菌和水稻白葉枯病菌的最低抑菌濃度為125 μg/mL。采用生長速率法測定提取物對10種植物病原真菌[香蕉酸腐病菌（Geotrichum candidum Link ex Pers）、蘋果輪紋病菌（Physalospora nasei）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、蘋果腐爛病菌（Valsa mali）、玉米小斑病菌（Helminthosporium maydwas）、葡萄黑痘病菌（Sphaceloma ampelinum）、蘋果斑點落葉病菌（Alternarial ternate f.sp.mali）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum）、番茄棉腐病菌（Pythium ultimum）]的抑制作用，發現除對蘋果輪紋病菌的抑制效果較好外（抑制率為56.3%），對其余供試菌的抑制率均低于50%。

關鍵詞：卷柏（Selaginella tamariscina）；提取物；植物病原菌；抑菌活性

中圖分類號：R 285.5；Q946.887；S482.2+92 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）18-4320-04

卷柏（Selaginella tamariscina）為蕨類植物門卷柏科（Selaginellaceae）卷柏屬（Selaginella）植物[1]。卷柏屬植物含有黃酮類化合物、酚類化合物及多糖類物質等化學活性成分[2，3]。已有研究發現，卷柏具有抗病毒[4]、降糖[5]、抗氧化[6]、抗腫瘤[7]及舒張血管[8]等藥理活性。關于卷柏提取物及化學成分的抑菌活性已有報道，周仁超等[9]研究發現兗州卷柏（Selaginella involvens Spring）水提物對變形桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌和痢疾桿菌有一定的抑菌作用。魯曼霞等[2]報道兗州卷柏穗花杉雙黃酮、β-D-glucopyranoside-（3β）-cholest-5-en-3yl和β-香樹脂醇對肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和綠膿桿菌具有不同的抑制效果，韓國學者Jung等[10]研究了卷柏（Selaginella tamansina）穗花杉雙黃酮對幾種真菌的抑制效應，發現對釀酒酵母菌、黃曲霉、白色念珠菌、白吉利毛孢子菌具有較好的抑制活性。還有研究[11，12]發現卷柏多糖及炔酚類化合物對動植物病原菌也具有抑制活性。研究卷柏及其有效成分對植物病原菌的抑制作用的報道較為少見，陳曉清等[11]報道卷柏多糖對甘薯薯瘟病菌、玉米大斑病菌、稻瘟病菌、甘蔗黑穗病菌、爛尾病菌有抑制效應。本研究針對14種常見的農作物病原細菌與真菌，測定卷柏乙醇提取物對其的抑制作用，目的在于豐富卷柏的抑菌作用譜，探索其作為植物源殺菌劑的潛力。

1 材料與方法

1.1 卷柏及乙醇提取物

卷柏干燥全草購自綿陽本地中藥材公司，經綿陽師范學院羅明華教授鑒定。卷柏樣品粉碎，用95%乙醇80 ℃回流提取3次（料液比10∶1），合并提取液，減壓濃縮后用石油醚脫脂，40 ℃烘干得卷柏乙醇提取物。

1.2 供試菌種

細菌：柑橘潰瘍病菌（Xanthomonas Campestris pv.citri），姜瘟病菌（Ralstonia solanacearum），水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae），大白菜軟腐病菌（Erwinia carotovora pv. carotovora），由四川大學農藥與作物保護研究所提供。

真菌：香蕉酸腐病菌（Geotrichum candidum Link ex Pers），蘋果輪紋病菌（Physalospora nasei），油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum），小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum），蘋果腐爛病菌（Valsa mali），玉米小斑病菌（Helminthosporium maydwas），葡萄黑痘病菌（Sphaceloma ampelinum），蘋果斑點落葉病菌（Alternarial ternate f.sp.mali），棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum），番茄棉腐病菌（Pythium ultimum），由西南科技大學生物科學實驗中心保存。

1.3 供試藥液

卷柏乙醇提取物用1% NaOH溶解并配制成濃度為1 mg/mL的母液，將母液按倍數稀釋法配成濃度為0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL的供試液，置于4 ℃冰箱備用。

將青霉素鈉用20%甲醇溶解配成0.5 mg/mL的母液，將母液按倍數稀釋法配成濃度為0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg/mL的溶液，置于4 ℃冰箱備用。

1.4 菌種活化

1.4.1 細菌活化采用液體牛肉膏蛋白胨培養基[13] 將冰箱保存的細菌菌種分別接一環于20 mL滅菌的液體牛肉膏蛋白胨培養基中，37 ℃恒溫培養箱內培養18～24 h。

1.4.2 真菌活化采用PDA培養基[13] 接種真菌的菌餅（直徑6 mm）于20 mL PDA平板培養基中心，28 ℃恒溫培養箱內培養，直至菌絲長滿整個培養皿。

1.5 抑制細菌活性測定

采用牛津杯法測定卷柏乙醇提取物對4種植物病原細菌的抑制效應，參考劉健等[14]的方法并略作改動。倒好平板并冷卻，吸取菌懸液0.2 mL置于平板培養基上并涂布均勻。靜置5 min后每板等距放入5個牛津杯，其中3個牛津杯加入0.2 mL的提取物母液，其余兩個分別加入0.2 mL的1% NaOH溶液和0.2 mL 的0.5 mg/mL 青霉素鈉溶液，分別作為陰性對照和陽性對照。每菌種重復3次。于37 ℃培養48 h后測定抑菌圈大小。

采用打孔法測定卷柏乙醇提取物對4種植物病原細菌的最低抑菌濃度（MIC），參考曾維才等[15]的方法并略作改動。吸取1 mL菌懸液于培養皿中，加入24 mL 牛肉膏蛋白胨培養基（45～50 ℃），使菌液與培養基充分混勻，靜置冷卻。用直徑6 mm打孔器打孔，分別加入提取物的不同濃度供試液100 μL。于37 ℃培養48 h后觀察抑菌情況，以抑菌圈直徑為7 mm及以上的供試液濃度作為最低抑菌濃度。青霉素鈉陽性對照采用同樣方法測定其MIC。

1.6 抑制真菌活性測定

采用生長速率法[16]測定卷柏的乙醇提取物對10種植物病原真菌的抑制作用。吸取1 mL濃度為1 mg/mL的提取液于培養皿中，加入24 mL PDA培養基（45～50 ℃），充分混勻，靜置冷卻。接種活化的真菌菌餅（直徑6 mm）于培養皿中心。空白對照接種同樣的菌餅，但不加待測液。每一菌種及空白對照均設3次重復。于28 ℃恒溫培養3～8 d，每24 h觀察1次，待空白對照的菌絲長滿培養皿時，用十字交叉法測量各菌落生長直徑，計算抑制率。

1.7 數據統計與分析

數據采用DPS 7.05數據分析軟件進行統計分析，差異顯著性分析采用最小顯著差異法（LSD法）。

2 結果與分析

2.1 卷柏乙醇提取物對4種植物病原細菌的抑制作用

采用牛津杯法測定卷柏的乙醇提取物對4種病原細菌的抑制活性，結果見表1。在供試濃度為1 mg/mL時，乙醇提取物對姜瘟病菌、柑橘潰瘍病菌、大白菜軟腐病菌的抑菌圈直徑均超過15 mm，而對水稻白葉枯病菌的抑菌圈為13.6 mm，統計分析表明4個菌種間均差異不顯著（p<0.05）。

最低抑菌濃度測定結果（表2）表明，乙醇提取物對姜瘟病菌和水稻白葉枯病菌的MIC均為125 μg/mL，而對大白菜軟腐病菌和柑橘潰瘍病菌的MIC均為250 μg/mL。青霉素鈉陽性對照的MIC明顯低于卷柏提取物，對姜瘟病菌、水稻白葉枯病菌、大白菜軟腐病菌的MIC均為12.5 μg/mL，對柑橘潰瘍病的MIC均為25 μg/mL。

2.2 卷柏乙醇提取物對植物病原真菌的抑制作用

采用生長速率法測定卷柏乙醇提取物對10種植物病原真菌的抑制作用，結果（表3）表明，在濃度為1 mg/mL時，乙醇提取物對所有供試真菌的抑制作用均較弱，抑制率最高的僅56.3%（蘋果輪紋病菌），對其余9種真菌的抑制率均低于50%。

3 小結與討論

研究發現卷柏乙醇提取物對柑橘潰瘍病菌、姜瘟病菌、水稻白葉枯病菌和大白菜軟腐病菌具有較好的抑制作用（抑菌圈直徑為13.6～15.3 mm），與陳曉清等[11]采用濾紙片法測定卷柏多糖抑制甘薯薯瘟病菌的結果相似（抑菌圈直徑為14.8 mm），而周仁超等[9]采用濾紙片法測定，發現兗州卷柏水提物對變形桿菌、 金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、痢疾桿菌的抑制作用在不同菌種間差異較大（抑菌圈直徑為9～28 mm）。根據NCCLS推薦標準[17]，4種供試細菌對卷柏乙醇提取物的敏感性為中敏至高敏。

從最低抑菌濃度測定結果看，卷柏乙醇提取物對4種供試細菌的MIC為125～250 μg/mL，而從兗州卷柏中分離的穗花杉雙黃酮和β-香樹脂醇對肺炎鏈球菌以及β-D-glucopyranoside-（3β）-cholest-5-en-3yl對金黃色葡萄球菌則具有極好的抑制作用（MIC為16 μg/mL）[2]。Cao等[12]的研究也發現卷柏中3個新型炔酚類化合物對金黃色葡萄球菌有很強抑制活性（MIC低于10 μg/mL）。這表明從卷柏乙醇提取物中可以進一步分離獲得具有很好抑制植物病原細菌的活性物質。

卷柏中的黃酮類、酚類化合物及多糖物質可能對細菌的生長起到抑制作用，其作用機制可能是抑制細菌核酸合成、影響細菌細胞膜的結構與透性或抑制細胞能量代謝[18，19]。

本研究結果表明，卷柏乙醇提取物對植物病原真菌的抑制效果較弱，抑制率最高僅為56.3%，這可能與提取物中抑菌有效成分含量較低有關。若對乙醇提取物進一步分離純化，提高其有效成分含量，或分離獲得穗花杉雙黃酮等活性物質，可能會有更好的抑制真菌效果。研究已經發現卷柏穗花杉雙黃酮對釀酒酵母菌、白色念珠菌具有很強的抑制作用（MIC為5 μg/mL）[10]，卷柏多糖對甘薯薯瘟病菌、綠色木霉和腸炎病菌也具有較好的抑制活性（MIC為6.25 mg/mL）[11]。這說明卷柏中存在對部分真菌具有很好抑制效果的活性物質，因此后續研究可對卷柏乙醇提取物進行分離純化，進一步研究其對供試真菌的抑制效果或擴大抑菌作用篩選范圍，以確定卷柏抑制植物病原真菌的潛力。

參考文獻：

[1] 賀光東.卷柏活性成分研究[D].河南開封：河南大學.2009.

[2] 魯曼霞，黃可龍，施樹云，等.兗州卷柏化學成分及體外抗菌活性研究[J].天然產物研究與開發，2009，21（6）：973-975.

[3] YANG S F， CHU S C， LIU S J， et al. Antimetastatic activities of Selaginella tamariscina （Beauv.） on lung cancer cells in vitro and in vivo[J]. J Ethnopharmacol， 2007， 110（3）：483-489.

[4] MA S C， HE Y H， VINCENT E O， et al.Antiviral amento-avone from Selaginella sinensis[J]. Biol Pharm Bull， 2001， 24（3）：311-312.

[5] ZHENG X K， LI Y J， LI Z， et al. Antihyperglycemic activity of Selaginella tamariscina（Beauv.） Spring[J]. J Ethnopharmacol，2011，133（2）：531-537.

[6] 徐 智，賈素潔，譚桂山，等.墊狀卷柏中雙黃酮藥理活性的研究[J].中國現代醫學雜志，2004，14（14）：88-89.

[7] 孫穎楨.3種卷柏屬藥用植物抗腫瘤作用的實驗研究[D].武漢： 湖北中醫藥大學，2008.

[8] 許 蘭，尹明浩.卷柏穗花杉雙黃酮的舒張血管作用實驗研究[J].延邊大學醫學學報，2009，32（4）：246-248.

[9] 周仁超，李淑彬.蕨類植物抗菌作用的初步研究[J].湖南中醫藥導報，1999，11（4）：13-14.

[10] JUNG H J， SUNG W S， YEO S H， et al. Antifungal effect of amentoflavone derived from Selaginella tamariscina[J]. Arch Pharm Res，2006，29（9）：746-751.

[11] 陳曉清，蘇育才，陳鄭鑌.抗菌卷柏多糖的提取與分離[J] .亞熱帶農業研究，2009，5（2）：98-101.

[12] CAO Y， CHEN J J， TAN N H，et al. Anitimicrobial selaginellinderivative from Selaginell apulvinata[J]. Bioorg Med Chem Lett，2010，20（8）：2456-2460.

[13] 張 玲.微生物學實驗指導[M].北京：北京交通大學出版社，2007.

[14] 劉 健，王海雁，趙淑江.牛津杯法測定五倍子對大黃魚病原弧菌的體外抑菌活力[J].海洋科學，2009，33（11）：44-47.

[15] 曾維才，譚 敏，張佳琪.不同抑菌方法在食品防腐劑效果評價方面的比較[J].食品安全質量檢測學報，2010，27（3）：112-117.

[16] 楊順義，郭東艷，沈慧敏，等.蒼耳等14種植物對植物病原菌的抑菌活性[J].植物保護，2006，32（3）：68-71.

[17] 李雅軍，張 斌，王 華.2006年CLSI/NCCLS藥敏標準的更新（CLSI/NCCLS M100-S16代替M100-S15）[J].江西醫學檢驗，2006，24（4）：355-356.

[18] CUSHNIE T P， LAMB A J. Antimicrobial activity of flavonoids[J]. Inter J Antimicro Agents，2005，26（5）：343-356.

[19] 玄紅專，胡福良.黃酮類化合物抑制微生物活性及其作用機制[J].天然產物研究與開發，2010，22（1）：171-175.

[4] MA S C， HE Y H， VINCENT E O， et al.Antiviral amento-avone from Selaginella sinensis[J]. Biol Pharm Bull， 2001， 24（3）：311-312.

[5] ZHENG X K， LI Y J， LI Z， et al. Antihyperglycemic activity of Selaginella tamariscina（Beauv.） Spring[J]. J Ethnopharmacol，2011，133（2）：531-537.

[6] 徐 智，賈素潔，譚桂山，等.墊狀卷柏中雙黃酮藥理活性的研究[J].中國現代醫學雜志，2004，14（14）：88-89.

[7] 孫穎楨.3種卷柏屬藥用植物抗腫瘤作用的實驗研究[D].武漢： 湖北中醫藥大學，2008.

[8] 許 蘭，尹明浩.卷柏穗花杉雙黃酮的舒張血管作用實驗研究[J].延邊大學醫學學報，2009，32（4）：246-248.

[9] 周仁超，李淑彬.蕨類植物抗菌作用的初步研究[J].湖南中醫藥導報，1999，11（4）：13-14.

[10] JUNG H J， SUNG W S， YEO S H， et al. Antifungal effect of amentoflavone derived from Selaginella tamariscina[J]. Arch Pharm Res，2006，29（9）：746-751.

[11] 陳曉清，蘇育才，陳鄭鑌.抗菌卷柏多糖的提取與分離[J] .亞熱帶農業研究，2009，5（2）：98-101.

[12] CAO Y， CHEN J J， TAN N H，et al. Anitimicrobial selaginellinderivative from Selaginell apulvinata[J]. Bioorg Med Chem Lett，2010，20（8）：2456-2460.

[13] 張 玲.微生物學實驗指導[M].北京：北京交通大學出版社，2007.

[14] 劉 健，王海雁，趙淑江.牛津杯法測定五倍子對大黃魚病原弧菌的體外抑菌活力[J].海洋科學，2009，33（11）：44-47.

[15] 曾維才，譚 敏，張佳琪.不同抑菌方法在食品防腐劑效果評價方面的比較[J].食品安全質量檢測學報，2010，27（3）：112-117.

[16] 楊順義，郭東艷，沈慧敏，等.蒼耳等14種植物對植物病原菌的抑菌活性[J].植物保護，2006，32（3）：68-71.

[17] 李雅軍，張 斌，王 華.2006年CLSI/NCCLS藥敏標準的更新（CLSI/NCCLS M100-S16代替M100-S15）[J].江西醫學檢驗，2006，24（4）：355-356.

[18] CUSHNIE T P， LAMB A J. Antimicrobial activity of flavonoids[J]. Inter J Antimicro Agents，2005，26（5）：343-356.

[19] 玄紅專，胡福良.黃酮類化合物抑制微生物活性及其作用機制[J].天然產物研究與開發，2010，22（1）：171-175.

[4] MA S C， HE Y H， VINCENT E O， et al.Antiviral amento-avone from Selaginella sinensis[J]. Biol Pharm Bull， 2001， 24（3）：311-312.

[5] ZHENG X K， LI Y J， LI Z， et al. Antihyperglycemic activity of Selaginella tamariscina（Beauv.） Spring[J]. J Ethnopharmacol，2011，133（2）：531-537.

[6] 徐 智，賈素潔，譚桂山，等.墊狀卷柏中雙黃酮藥理活性的研究[J].中國現代醫學雜志，2004，14（14）：88-89.

[7] 孫穎楨.3種卷柏屬藥用植物抗腫瘤作用的實驗研究[D].武漢： 湖北中醫藥大學，2008.

[8] 許 蘭，尹明浩.卷柏穗花杉雙黃酮的舒張血管作用實驗研究[J].延邊大學醫學學報，2009，32（4）：246-248.

[9] 周仁超，李淑彬.蕨類植物抗菌作用的初步研究[J].湖南中醫藥導報，1999，11（4）：13-14.

[10] JUNG H J， SUNG W S， YEO S H， et al. Antifungal effect of amentoflavone derived from Selaginella tamariscina[J]. Arch Pharm Res，2006，29（9）：746-751.

[11] 陳曉清，蘇育才，陳鄭鑌.抗菌卷柏多糖的提取與分離[J] .亞熱帶農業研究，2009，5（2）：98-101.

[12] CAO Y， CHEN J J， TAN N H，et al. Anitimicrobial selaginellinderivative from Selaginell apulvinata[J]. Bioorg Med Chem Lett，2010，20（8）：2456-2460.

[13] 張 玲.微生物學實驗指導[M].北京：北京交通大學出版社，2007.

[14] 劉 健，王海雁，趙淑江.牛津杯法測定五倍子對大黃魚病原弧菌的體外抑菌活力[J].海洋科學，2009，33（11）：44-47.

[15] 曾維才，譚 敏，張佳琪.不同抑菌方法在食品防腐劑效果評價方面的比較[J].食品安全質量檢測學報，2010，27（3）：112-117.

[16] 楊順義，郭東艷，沈慧敏，等.蒼耳等14種植物對植物病原菌的抑菌活性[J].植物保護，2006，32（3）：68-71.

[17] 李雅軍，張 斌，王 華.2006年CLSI/NCCLS藥敏標準的更新（CLSI/NCCLS M100-S16代替M100-S15）[J].江西醫學檢驗，2006，24（4）：355-356.

[18] CUSHNIE T P， LAMB A J. Antimicrobial activity of flavonoids[J]. Inter J Antimicro Agents，2005，26（5）：343-356.

[19] 玄紅專，胡福良.黃酮類化合物抑制微生物活性及其作用機制[J].天然產物研究與開發，2010，22（1）：171-175.