BRAF基因突變檢測在甲狀腺乳頭狀病變中的臨床意義

張 翼 李 惠 陳 劼 張士虎

1.江蘇省中醫院急診外科，江蘇南京 210029；2.江蘇省中醫院病理科，江蘇南京 210029

甲狀腺癌是最常見的內分泌腫瘤，主要包括乳頭狀癌、濾泡狀癌、髓樣癌和未分化癌，其中甲狀腺乳頭狀癌最常見，約占85%～90%，以女性多發[1]。由于多種因素，導致甲狀腺腫瘤的發病率呈現逐年上升趨勢。良性甲狀腺病變中常出現乳頭狀病變，當乳頭出現不典型增生時易誤診為癌，從而擴大手術范圍，給病人造成不必要的傷害，因此對其性質鑒別具有重要臨床意義。而肉眼及顯微鏡下的觀察診斷具有一定的主觀性，這就需要一個客觀的臨床檢測指標幫助辨別良惡性。目前多項研究[2,3]指出甲狀腺乳頭狀癌和BRAF V600E突變密切相關，此突變在甲狀腺其他良惡性腫瘤中突變率非常低，具有一定特異性，而BRAF V600E在甲狀腺不典型乳頭狀腺瘤中的突變情況尚無人報道。為探討BRAF基因在甲狀腺乳頭狀病變中的突變情況及臨床意義，該研究選取2009年11月—2013年3月以來到該院就診的56例甲狀腺乳頭狀病變的患者，采用直接測序法分析了甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺不典型乳頭狀腺瘤的BRAF基因突變情況，探討其在鑒別診斷中的價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2009年11月—2013年3月江蘇省中醫院病理科54例甲狀腺乳頭狀病變石蠟標本,男16例,女38例;平均年齡4419～70歲。其中甲狀腺乳頭狀癌24例（包括微乳頭癌6例）,甲狀腺不典型乳頭狀腺瘤30例。所有組織標本均經病理證實，診斷參考2004年WHO診斷標準[4]。甲狀腺乳頭狀癌患者行單側及峽部全切加頸部淋巴結清掃,甲狀腺微小乳頭狀癌患者行單側及峽部全切加中央區淋巴結清掃，不典型腺瘤行甲狀腺次全切除術，所有患者目前均存活。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA提取 切取5張10 um厚石蠟白片，脫蠟消化后提取DNA。具體方法見試劑盒說明書（Omega FFPE DNA Kit，USA）。以凝膠電泳系統檢測DNA模板的質量。

1.2.2 PCR擴增 使用ABI-2700型測序級擴增儀，擴增目的基因片段。 反應體系：10×PCR Buffer 2μL，HotStar Taq DNA Polymerase 0.25μL(Q IAGEN，USA)，5×Q-Solution 4μL,dNTP 2μL,Primer各 1μL,模板 DNA 1μL,去離子水 8.75μL。 95 ℃ 10 min;94℃50 s,57℃ 1 min,72℃1 min,共循環35次,最后于72℃延伸10 min。PCR產物純化具體方法見試劑盒說明書（AXYPrep PCR Cleanup Kit,USA）。

1.2.3 測序 測序方法[5]：在3100-Avant遺傳分析儀進行測序;Data collection軟件自動進行數據處理和分析。對于測序中發現有突變的病例,都進行反向測序驗證。將測序結果用DNA sequencing analysis5.1軟件分析原始測序數據,獲取測序電泳圖和序列。將樣品序列用AB I SeqScape軟件與genebank標準序列進行比對,觀察樣本基因序列的改變。

1.3 統計方法

數據處理使用SPSS 13.0軟件。計數資料采用χ2檢驗、Fisher’s確切概率法進行顯著性檢驗。

2 結果

經直接測序法測定，54例樣本成功檢測了BRAF第15外顯子突變情況，突變位點全部位于V600E位點，未發現其他類型突變。24例甲狀腺乳頭狀癌，16例發現BRAF基因15外顯子第600位密碼子A/T雜合（V600E），突變率為 66.7%（16/24）。 而 30例甲狀腺不典型腺瘤樣本中未發現V600E位點病理性突變（0/30）,兩者差異有統計學意義（P<0.01）。見表1。研究結果還顯示，BRAF V600E突變與性別、年齡、腫瘤大小無關，差異無統計學意義（P>0.05），與組織學類型相關。見表2。

表1 54例甲狀腺乳頭狀病變樣本中BRAF基因突變率

表2 BRAF基因突變與甲狀腺乳頭狀病變患者臨床病理特征的關系

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌組織光鏡下多表現為乳頭狀，細胞核毛玻璃樣，可觀察到核溝，核內包涵體，間質中含有砂粒體，此為重要的特征。而當乳頭由于冰凍處理或者其他原因造成不典型時與腺瘤難以鑒別。免疫組化可以用于鑒別診斷，但是免疫組化操作過程中易出現假陰性或者假陽性，人工判讀結果也有一定的主觀性，易造成誤診。兩者治療和預后差別很大，需要一個客觀的檢測指標。

BRAF基因為RAF家族成員，位于7號染色體，是編碼B型有絲分裂原激活的蛋白激酶依賴性激酶的激酶。研究顯示，BRAF基因第15位外顯子上的T1799A點突變（V600E）導致BRAF中的纈氨酸(V)被谷氨酸(E)替代，進而持續激活BRAF激酶，造成MAPK通路持續活化，細胞不斷分裂、增殖，進而形成腫瘤[6]。在轉基因小鼠中通過BRAF突變的表達，可誘導出乳頭狀癌，表明了BRAF基因在乳頭狀癌起始中的重要作用[7]。Fukushima等[8]檢測了100例甲狀腺癌的BRAF基因突變情況，發現BRAF基因的突變僅存在甲狀腺乳頭狀癌中，而且僅發現了V600E突變,陽性率為53%(40/76).多項研究[9-11]顯示甲狀腺乳頭狀癌中BRAF基因突變率為29%～87%，而濾泡型腺癌和所有良性病變如單純性甲狀腺腫則無此突變。Zhang[11]等發現在甲狀腺細針穿刺標本中71.4%發生BRAF V600E突變，所有BRAF(V600E)陽性的標本甲狀腺切除術后都被證實為甲狀腺乳頭狀癌。最近的研究還顯示，BRAF（V600E）突變的發生率有地區差異。例如，BRAF V600E突變率在韓國（52%～87%）比其他國家（36%～65%）高[3]。造成這種差異的原因尚不清楚，可能是由于地理因素。一些研究報道了在高碘攝入區BRAF V600E突變率更高，這可能表明碘過量攝入是乳頭狀癌BRAFV600E突變的一個危險因素[12]。

甲狀腺乳頭狀癌的預后較好，十年生存率超過90%。但是35%的患者在長期隨訪中有復發[13]。甲狀腺乳頭狀癌的預后與多種因素相關，包括年齡、多灶性、腫瘤最大徑、甲狀腺外浸潤性的生長方式及缺乏腫瘤相關性纖維包膜等。研究顯示BRAF V600E突變在經典型甲狀腺乳頭狀癌中確與侵犯表型相關，BRAF V600E影響腫瘤的生長方式，促進浸潤轉移發生，進而影響甲狀腺乳頭狀癌患者臨床預后[14]。這對于甲狀腺乳頭狀癌患者的診斷和治療具有重要意義。Yong[15]等研究顯示73.7%的甲狀腺乳頭狀癌中發現BRAF V600E突變。淋巴結轉移，TNM分期，多灶性與BRAF V600E突變并無顯著相關。然而，腫瘤大小，甲狀腺外侵犯，組織學類型以及并發橋本氏甲狀腺炎與BRAF V600E突變有關聯。在一項回顧性多中心研究中[16]，BRAF V600E突變的存在增加了甲狀腺乳頭狀癌的死亡率。盡管這種聯系并不是獨立存在的，但支持了BRAF V600E突變對甲狀腺乳頭狀癌預后和治療影響的進一步研究。

綜上所述，BRAF V600E突變在鑒別甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺不典型乳頭狀腺瘤中具有重要意義，對患者的治療和預后有指導意義，直接測序法結果準確，價格低廉，適合臨床推廣使用。

[1]Davies L,Welch HG.Increasing incidence of thyroid cancer in the U-nited States[J].JAMA,2006,295(18):2164–2167.

[2]Caronia LM,Phay JE,Shah MH,et al.Role of BRAF in thyroid oncogenesis[J].Clin Cancer Res,2011,17(24):7511-7517.

[3]Kim KH,Kang DW,Kim SH,et al.Mutations of the BRAF gene in papillary thyroid carcinoma in a Korean population[J].Yonsei Med J,2004,45(5):818–821.

[4]DeLellis RA,LLoyd R,Heitz PU.WHO classification of tumors,pathology and genetics-tumors of endocrine organs[J].IARC Press,Lyon,2004.

[5]徐瑋,李惠，孫怡，等.軟組織肉瘤中C-KIT,PDGFRα基因突變的檢測結果分析[J].海南醫學,2013,23(24):3439-3442.

[6]Cantwell ER,O'Leary JJ,Sheils OM,et al.BRAFV600E:implications for carcinogenesis and molecular therapy[J].Mol Cancer Ther,2011,10(3):385-394.

[7]Sapio M R，Posca D，Troncone G，et a1.Detection of BRAF mutation in thyroid papillary carcinoma by mutant allele-specific PCR amplification(MASA)[J].EurJ Endocrinol，2006，154(2):341-348.

[8]Fukushima T,Takenoshita S.Roles of RAS and BRAF mutations in thyroid carcinogenesis[J].Fukushima J Med Sci,2005,51(2):67-75.

[9]Hwang J,Shin JH,Han BK,et al.Papillary thyroid carcinoma with BRAFV600E mutation:sonographic prediction[J].AJR Am J Roentgenol,2010,194(5):W425–430.

[10]Nikiforov YE,Nikiforova MN.Molecular genetics and diagnosis of thyroid cancer[J].Nat Rev Endocrinol,2011,7(10):569-580.

[11]Zhang B,Liu S,Zhang Z,et a1.Analysis of BRAF(V600E)mutation and DNA methylation improves the diagnostics of thyroid fine needle aspiration biopsies[J].Diagn Pathol,2014（9）:45.

[12]Guan H,Ji M,Bao R,et a1.Association of high iodine intake with the T1799A BRAF mutation in papillary thyroid cancer[J].J Clin Endocrinol Metab,2009,94(5):1612–1617.

[13]Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et a1.Global cancer statistics,2002[J].CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-108.

[14]Eloy C,Santos J,Soares P,et a1.The preeminence of growth pattern and invasiveness and the limited influence of BRAF and RAS mutations in the occurrence of papillary thyroid carcinoma lymph node metastases[J].Virchows Archiv,2011,459(3):265-276.

[15]Yong SK,Jeong SK,Ja SB,et a1.Clinical implication of the BRAFV600E mutation in papillary thyroid carcinoma[J].World J Surg Oncol,2013（11）:99.

[16]Xing M,Alzahrani AS,Carson KA,et a1.Association between BRAF V600E mutation and mortality in patients with papillary thyroid cancer[J].JAMA,2013,309(14):1493-1501.