中晚期肝癌患者外周血淋巴細胞亞群的研究

廖 媛 陳亞瓊

中山大學附屬第三醫院檢驗科，廣東廣州 510630

肝細胞肝癌（Hepatocellular Carcinoma，簡稱肝癌或 HCC）占原發性肝癌的90%以上，其發病率和死亡率在全球范圍內分別位列第6位和第3位[1]。我國是肝癌的高發區，發病人數約占全球的54%[2]。由于肝癌的自然病程較長、起病隱匿，超過80%的肝癌在就診時已屬于中晚期，無法進行根治性切除手術，療效欠佳、預后差[3-4]。機體免疫狀態對肝癌的療效和預后有重要影響[5]。正常情況下，機體的免疫監控機制可消滅絕大多數異常的細胞。但極少數惡性細胞不僅在發生的過程中獲得了免疫逃逸的能力形成腫瘤，后者更可以在發展的過程中，通過多種手段來調控機體的免疫應答來幫助自身的進展和轉移[6]。淋巴細胞是免疫系統的重要組成成分，在腫瘤發生發展中起到重要作用[7]。在腫瘤微環境中，既存在殺傷型免疫細胞，如NK細胞、CTL細胞等，它們能直接或通過分泌細胞因子殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤生長；也存在某些調節性或抑制型免疫細胞，如Treg細胞等，它們非但不能清除腫瘤，反而在腫瘤的發生發展過程中抑制其他效應細胞的抗腫瘤作用。該文采用流式細胞術對69例中晚期肝癌患者外周血各淋巴細胞亞群進行對比性研究，旨在探討中晚期肝癌患者細胞免疫功能的變化及意義。報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗對象、樣本采集和處理

肝癌患者外周血由中山大學腫瘤防治中心肝膽外科提供。實驗符合赫爾辛基宣言（The Declaration of Helsinki）的相關規定，所有患者均已簽署知情同意書并得到中山大學倫理委員會的批準[8]。肝細胞性肝癌的診斷標準依據European Association for the Study of the Liver（EASL）的標準[9]。臨床腫瘤分期依據國際抗癌聯盟制定的TNM分期（第6版）。所有患者治療前未接受任何抗腫瘤治療。20例健康人外周血由廣州市血液中心提供。

1.1.1 實驗組 從2011年6月—2012年5月期間，共收集中晚期（TNM III期）肝癌患者69例。其中男62例，女7例，年齡26～75歲，中位年齡50歲。

1.1.2 對照組 研究期間同時收集了28例早期（TNM I期）肝癌患者和20例健康人的外周血作為對照。其中早期肝癌患者，男27例，女1例，年齡32～69歲，中位年齡48歲；健康人，男17例，女3例，年齡25～55歲，中位年齡44歲。2個對照組與實驗組性別、年齡差異無統計學意義（P>0.05）。

1.1.3 樣本采集和處理 所有入組病例于治療前2～3 d抽取清晨空腹外周靜脈血6 mL進行分析。肝素抗凝管收集，收集后6 h內進行處理。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 實驗儀器 流式細胞儀為美國Beckman Coulter公司生產，型號為FC500。

1.2.2 實驗試劑 流式細胞術熒光抗體：CD3-APC、CD3-ECD、CD4-FITC、CD4-PC7、CD8-PE、IFN-γ-PE 購自美國Beckman Coulter公司；CD3-FITC、CD56-PC7購自美國 BD公司；IL-17AAF647、FoxP3-APC購自美國eBioscience公司。IL-17固定破膜試劑盒（IntraPre Reagent）購自美國Beckman Coulter公司。FoxP3固定破膜試劑盒購自美國eBioscience公司。白細胞活化劑購自美國BD公司。Ficoll淋巴細胞分離液購自天津灝洋公司。

1.3 淋巴細胞亞群檢測

采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞。胞內抗原IL-17和IFN-γ的檢測用白細胞活化劑刺激細胞4h之后進行染色。 取50μL細胞（1×104/μL），加入適量的表面抗體，4 ℃避光孵育30min，PBS洗1次，離心（4 ℃，380 g，8 min），棄上清。胞內抗原染色：加入50μL固定劑，室溫避光孵育15min，PBS洗一次，離心棄上清，加入50μL破膜劑，室溫避光孵育5 min，加入適量的胞內抗體，4℃避光孵育30 min，PBS洗1次，離心棄上清，以500μLPBS重懸細胞，用流式細胞儀FC500檢測。核內抗原FoxP3染色：加入400μL固定液，4℃避光孵育30 min，PBS洗1次，離心棄上清，加入1 mL通透液，離心棄上清，加入適量Foxp3-APC抗體，4℃避光孵育45 min，加入1 mL通透液，離心棄上清，以500μLPBS重懸細胞，用流式細胞儀FC500檢測。數據采用CXP analysis軟件分析。

1.4 統計方法

采用SPSS 13.0軟件對數據進行統計分析。連續變量以均數±標準差形式表示，組間的均值差異學分析采用Mann-Whitney U檢驗。分類變量以頻數的形式表示，用χ2檢驗進行對比分析。相關性分析采用Pearson相關系數分析。

2 結果

2.1 中晚期肝癌患者臨床特征

中晚期肝癌患者腫瘤負荷大、生長迅速，常伴有癌栓、腫瘤轉移等，有著與早期肝癌患者不同的特征。本研究中我們首先比較了不同分期肝癌患者的生化指標，發現相對早期肝癌患者，中晚期肝癌患者肝功能的多項指標，如甲胎蛋白（AFP）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、谷氨酰轉肽酶（GGT）和乳酸脫氫酶（LDH）等均顯著上升；反映機體炎癥狀態的指標，如外周血C-反應蛋白（CRP）、白細胞總數（WBC）和中性粒細胞/淋巴細胞比值（NLR）也明顯升高，而外周血淋巴細胞數目卻有所下降，見表1。

2.2 中晚期肝癌外周血淋巴細胞表型

該研究利用流式細胞術分別檢測了不同分期肝癌患者外周血淋巴細胞亞群的比例。該研究首先通過檢測表面標記對CD3+T、CD4+T、CD8+T、NK及NKT細胞進行了分析，結果表明早期和中晚期肝癌患者外周血中上述淋巴細胞亞群比例均與健康人相當。該研究進一步通過檢測胞內細胞因子以及核內轉錄因子水平將CD4+T和CD8+T細胞分為不同的功能亞群：Th1（IFN-γ+/CD4+T）、Th17（IL-17+/CD4+T）、Treg（CD25+Foxp3+/CD4+）、和Tc1（IFN-γ+/CD8+T）。通過各組之間的比較我們發現，與健康人相比，中晚期肝癌患者外周血Th1、Th17以及Treg比例顯著升高；與早期肝癌患者相比，中晚期肝癌患者外周血Th17細胞比例也明顯升高，而Tc1細胞比例卻顯著下降，Th1和Treg細胞則無明顯差異，見圖1。

表1 不同TNM分期肝癌患者臨床指標對比

圖1 健康人和肝癌患者治療前外周血Th1、Th17、Treg和Tc1細胞亞群比例及比較

2.3 中晚期肝癌臨床指標與免疫指標相關性分析

腫瘤的生長、浸潤、轉移狀況與機體的免疫監控狀態密切相關，而淋巴細胞亞群之間也可能存在相互促進或抑制的關系。因此我們將治療前外周血炎癥指標、淋巴細胞亞群比例和血漿細胞因子水平與臨床指標進行相關性分析，結果發現：①外周血中CRP（r=0.295，P=0.015）和 NLR（r=0.363，P=0.002）水平均與腫瘤大小呈正相關，而外周血淋巴細胞亞群比例CD3+T%（r=-0.260，P=0.031）、Th1%（r=-0.248，P=0.043）則與腫瘤大小呈負相關；②CD3+T%（r=-0.283，P=0.019）、Th1%（r=-0.267，P=0.029）同時也與 AFP 呈負相關； ③CD4+T%（r=0.319，P=0.008）、Foxp3+/T%（r=0.275，P=0.026）與腫瘤血管侵犯呈正相關，CD8+%（r=-0.322，P=0.007）、NKT%（r=-0.263，P=0.029）則與腫瘤血管侵犯呈負相關；④WBC（r=0.337，P=0.005）、NLR（r=0.554，P=0.000）均與 CRP 呈正相關。

3 討論

隨著腫瘤的進展，肝癌細胞會不斷增殖和侵襲，對正常肝細胞造成損傷，同時也會釋放一系列趨化因子、炎癥因子和生長因子，招募各種免疫細胞浸潤至腫瘤及周圍組織。該研究發現，中晚期肝癌患者外周血中一系列反應機體炎癥水平的指標如CRP、WBC、NLR都明顯高于早期肝癌患者，且伴隨多項反映肝功能損傷指標的上升。相關性分析發現，CRP、NLR水平均與腫瘤大小呈正相關，提示這種高水平的炎癥狀態可能有利于腫瘤的生長及侵襲。

既往的研究表明，肝癌患者體內具有殺傷功能的CTL、NK等淋巴細胞的數目或功能被不同程度地下調或抑制[10]。該研究發現，與早期肝癌相比，中晚期肝癌外周血Tc1細胞比例顯著下降，這可能與腫瘤進展過程中Tc1和Tc2平衡失調有關。

Treg細胞是一種重要的免疫抑制細胞，它可通過各種途徑抑制免疫反應，介導免疫逃逸。Zhou[11]等在肝癌患者中發現Treg細胞比例升高，且與患者預后呈負相關，但該研究未對不同分期肝癌患者Treg細胞的差異進行比較。該研究發現，中晚期肝癌患者外周血Treg比例顯著高于健康人，且與腫瘤血管侵犯呈正相關，但不同分期肝癌患者外周血Treg細胞的比例并無顯著差異，提示Treg細胞在肝癌外周血中的升高，可能是腫瘤發生后對全身免疫狀態的影響造成的，是肝癌患者免疫失衡的表現，也是腫瘤發生的一個重要的潛在檢測指標。

Th17細胞是一種新型的能產生IL-17A的CD4+T細胞，已被證實參與多種自身免疫疾病，但是目前對于其在腫瘤中的作用還存在爭議[12]。Zhang等[13]在肝癌中的研究發現，中晚期肝癌組織中IL-17A的表達水平高于早期肝癌，且與臨床預后呈負相關。該研究發現，中晚期肝癌外周血Th17細胞比例顯著高于健康人及早期肝癌。但Zhang等[13]的報道卻發現，中晚期肝癌外周血Th17細胞與健康人及早期肝癌均無顯著差異，這可能與其中晚期肝癌組樣本量小有關。

上述淋巴細胞亞群的變化提示，肝癌在進展過程中，能夠影響機體免疫平衡，使得免疫抑制型細胞占主導，從而幫助其生長侵襲。因此，中晚期肝癌除常規治療之外，可以針對患者免疫狀態采取相應的免疫干預措施，從而提高治療效果，延長患者的生存時間。

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